Continuous Control of the Flow in Biochemical Pathways through 5' Untranslated Region Sequence Modifications in mRNA Expressed from the Broad-Host-Range Promoter Pm
- 作者
- Rahmi Lale, Laila Berg, Friederike Stuttgen, Roman Netzer, Marit Stafsnes, Trygve Brautaset, Trond Erik Vee Aune, Svein Valla
- 单位
- Department of Biotechnology, Norwegian University of Science and Technology; Department of Biotechnology, SINTEF Materials and Chemistry, SINTEF
- 杂志
- Applied and Environmental Microbiology（2011）
- DOI
- 10.1128/AEM.02091-10
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
降低可诱导Pm启动子未诱导状态下的本底表达水平，同时保持其诱导性，以实现代谢通路流量的连续精细调控。
研究策略
对Pm启动子mRNA的5'UTR区域进行掺杂寡核苷酸诱变，筛选降低翻译效率的UTR变体，并验证其对不同报告基因和组成型启动子的通用性，最后应用于类胡萝卜素合成途径的流量控制。
核心内容
该研究通过修饰Pm启动子mRNA的5'UTR区域，实现对代谢通路流量的连续精细调控。研究者采用掺杂寡核苷酸诱变筛选出五个UTR变体（DI-1、-3、-4、-7、-8），这些变体在未诱导条件下显著降低本底表达，同时保持或提高诱导/未诱导比。变体功能不依赖特定基因和启动子类型，具有通用性。在荧光素酶报告系统中，诱导条件下蛋白活性降至野生型的0.4%–11%，而诱导/未诱导比值达105–260（野生型为97）。在sarcinaxanthin合成途径中，野生型UTR未诱导时产生约25%产物，DI-3变体未诱导时产量为零，而500 μM诱导剂下DI-8可达野生型的53%，5 mM诱导剂下DI-8达90%，DI-3仅为同条件下的17%。该研究提供了一种不依赖启动子和基因类型的通用工具，能独立于转录水平调控翻译效率，实现对目标产物从零到最大产量的连续控制，为代谢工程中精细调控代谢通路流量提供了简洁有效的新策略。
创新点
获得了五个UTR突变变体，可显著降低未诱导本底表达且保持或提高诱导/未诱导比；变体功能不依赖特定基因和启动子；首次将UTR变体用于消除未诱导条件下sarcinaxanthin的合成，实现从零到最大产量的连续调控。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli DH5α | Pm启动子表达系统 | bla | β-内酰胺酶 | 催化 | 报告基因，用于筛选UTR变体 |
| Escherichia coli DH5α | Pm启动子表达系统 | luc | 荧光素酶 | 催化 | 报告基因，用于定量检测表达水平 |
| Escherichia coli DH5α | Pm启动子表达系统 | celB | 磷酸葡萄糖变位酶 | 催化 | 报告基因，发现受Rho依赖性转录终止影响 |
| Escherichia coli XL1-Blue | 类胡萝卜素合成途径 | crtE2, crtYg, crtYh | C50类胡萝卜素合成酶 | 催化 | 源自藤黄微球菌，用于合成sarcinaxanthin |
| Escherichia coli | Pm启动子调控系统 | xylS | XylS转录激活因子 | 调控 | 调控Pm启动子的转录活性 |
| Escherichia coli | RK2复制系统 | trfA | TrfA复制起始蛋白 | 调控 | 控制质粒拷贝数 |
| Escherichia coli | 5'UTR翻译调控 | UTR variants | — | 调控 | 位于mRNA 5'非翻译区，通过降低翻译效率调控表达 |
关键发现
- 五个UTR变体（DI-1、-3、-4、-7、-8）在未诱导条件下均不使大肠杆菌在含5 μg/ml氨苄青霉素的培养基上生长，诱导条件下最高氨苄青霉素耐受水平为10–60 μg/ml
- luc报告基因在诱导条件下蛋白活性降至野生型的0.4%–11%，转录水平为36%–58%
- celB转录水平显著降低，Rho抑制剂bicyclomycin使DI-7的celB转录水平提高约40倍（野生型约10倍）
- 诱导/未诱导荧光素酶活性比值为105–260，野生型为97
- 在sarcinaxanthin生产中，野生型UTR未诱导时产生约25%的sarcinaxanthin，DI-8未诱导时为5%，DI-3未诱导时为0
- 500 μM诱导剂下野生型达到100%，DI-8为53%
- 5 mM诱导剂下DI-8达90%，DI-3仅为野生型同条件下的17%。
研究结论
5'UTR突变可独立于启动子和基因类型降低翻译效率，有效降低未诱导本底表达并保持诱导性，为代谢工程和合成生物学提供了一种精细调控代谢通路的通用工具，可实现对目标产物从零到最大产量的连续控制。