Activation-Independent Cyclization of Monoterpenoids
- 作者
- Gabriele Siedenburg, Dieter Jendroesek, Michael Breuer, Benjamin Juhl, Jürgen Pleiss, Miriam Seitz, Janosch Klebensberger, Bernhard Hauer
- 单位
- Institute of Microbiology, University of Stuttgart, Stuttgart, Germany; Fine Chemicals and Biocatalysis Research, BASFSE, Ludwigshafen, Germany; Institute of Technical Biochemistry, University of Stuttgart, Stuttgart, Germany
- 杂志
- Applied and Environmental Microbiology（2011）
- DOI
- 10.1128/AEM.07059-11
- 所属领域
- 生物催化
- 关键词
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解决的核心问题
传统单萜环化酶依赖焦磷酸活化的线性前体（牻牛儿基焦磷酸），限制了其工业应用。本文旨在发现能够催化非活化单萜底物（如香茅醛）环化的新型生物催化剂。
研究策略
对已知鲨烯-藿烯环化酶（SHC）进行基因组挖掘，从运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis）中鉴定出ZMO1548-Shc，通过异源表达、定点突变和同源建模/分子对接研究其环化活性和催化机制。
核心内容
本研究从运动发酵单胞菌中通过基因组挖掘鉴定出ZMO1548-Shc，一种不依赖焦磷酸活化的新型单萜环化酶。该酶能够直接催化非活化底物香茅醛环化为异胡薄荷醇，而传统的单萜环化酶通常需要焦磷酸化的线性前体。静息细胞表达ZMO1548-Shc可从20 mM香茅醛生成5 mM异胡薄荷醇（产率25%）；对关键残基F486进行丙氨酸突变（F486A）后，异胡薄荷醇产量提高至12 mM，约为野生型的3倍，同时鲨烯环化活性显著降低。相反，F486Y突变使鲨烯环化活性提高约50%，而香茅醛环化活性几乎完全丧失。分子对接显示香茅醛以反向、预成环构象结合，羰基朝向DxDD催化基序，与鲨烯的结合模式截然不同，表明该酶催化机制中由羰基而非末端双键接受质子。此外，纯化酶活力比静息细胞低10倍以上，提示细胞内环境对催化效率有重要影响。该发现扩展了萜烯环化酶的催化多样性，为利用非活化萜类底物工业合成环状单萜提供了新思路。
创新点
首次报道不依赖焦磷酸活化的单萜环化酶（ZMO1548-Shc）；发现其催化香茅醛环化为异胡薄荷醇的机制与鲨烯环化不同（羰基而非末端双键接受质子）；通过F486A突变将异胡薄荷醇产量提高近3倍。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3)(pLysS) | 萜类合成途径（三萜环化） | ZMO1548 | ZMO1548-Shc | 催化 | 来自运动发酵单胞菌的鲨烯-藿烯环化酶，具有非活化单萜环化活性，催化香茅醛生成异胡薄荷醇 |
| Escherichia coli BL21(DE3)(pLysS) | 萜类合成途径（三萜环化） | ZMO0872 | ZMO0872-Shc | 催化 | 运动发酵单胞菌的另一种鲨烯-藿烯环化酶，仅具有鲨烯环化活性，不能催化香茅醛 |
| Escherichia coli BL21(DE3)(pLysS) | 萜类合成途径（三萜环化） | shc | ShcAac | 催化 | 来自嗜酸脂环杆菌（Alicyclobacillus acidocaldarius）的鲨烯-藿烯环化酶，作为对照，未检测到单萜环化活性 |
| Escherichia coli BL21(DE3)(pLysS) | 萜类合成途径（单萜环化） | ZMO1548 (F486A) | ZMO1548-Shc F486A | 催化 | 定点突变体，对香茅醛环化活性提高约3倍（12 mM异胡薄荷醇），鲨烯环化活性显著降低 |
| Escherichia coli BL21(DE3)(pLysS) | 萜类合成途径（单萜环化） | ZMO1548 (F486Y) | ZMO1548-Shc F486Y | 催化 | 定点突变体，鲨烯环化活性增加约50%，香茅醛环化活性几乎丧失 |
| Escherichia coli BL21(DE3)(pLysS) | 萜类合成途径（单萜环化） | ZMO1548 (W374H) | ZMO1548-Shc W374H | 催化 | 定点突变体，鲨烯环化活性<1%残留，香茅醛环化活性仅降低16% |
关键发现
- 静息细胞表达ZMO1548-Shc可从20 mM香茅醛生成5 mM异胡薄荷醇（25%产率）
- F486A突变体异胡薄荷醇生成量达12 mM（约3倍提高），鲨烯环化活性显著降低
- F486Y突变体鲨烯环化活性提高约50%，香茅醛环化活性几乎完全丧失
- W374H突变体鲨烯环化活性<1%残留，香茅醛环化活性仅降低16%
- 纯化ZMO1548-Shc蛋白需约1 mg才能转化1 mM香茅醛（16小时），活力比静息细胞降低10倍以上
- 分子对接显示香茅醛以反向（羰基朝向DxDD基序）、预成环构象结合，与鲨烯的结合模式不同。
研究结论
ZMO1548-Shc是首个被描述的不依赖焦磷酸活化的单萜环化酶，能够环化不同长度的非活化萜类底物（单萜至三萜），其催化香茅醛环化遵循与鲨烯环化不同的机制，该发现扩展了萜烯环化酶的催化多样性，为工业合成环状单萜提供了新思路。