Evolutionary engineering improves tolerance towards jet fuel replacements in yeast
- 作者
- Timothy C. R. Brennan, Thomas C. Williams, Benjamin L. Schulz, Robin W. Palfreyman, Jens O. Kromer, Lars K. Nielsen
- 单位
- Australian Institute for Bioengineering and Nanotechnology, University of Queensland; Centre for Microbial Electrosynthesis (CEMES), Advanced Water Management Centre (AWMC), University of Queensland; School of Chemistry and Molecular Biosciences, The University of Queensland
- 杂志
- Applied and Environmental Microbiology（2017）
- DOI
- 10.1128/AEM.04144-14
- 所属领域
- 代谢工程 / 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
单萜类化合物（如柠檬烯）作为喷气燃料替代品前体具有高毒性，在酵母中其浓度达到60 mg/L即抑制生长，相毒性成为微生物生产单萜的关键瓶颈，亟需提高菌株对单萜类化合物的耐受性。
研究策略
采用适应性实验室进化（ALE）结合连续批次传代，在逐渐升高的柠檬烯压力下进化酿酒酵母S288C；对进化时间过程中的6个菌株进行全基因组重测序，鉴定关键突变；通过基因组重建验证单点突变的功能，并结合转录组、细胞壁蛋白组和细胞壁完整性分析解析耐受机制。
核心内容
本研究通过适应性实验室进化结合连续批次传代，在逐渐升高的柠檬烯压力下驯化酿酒酵母S288C，并利用时间序列全基因组重测序追踪进化过程中的关键突变。结果显示，进化菌株的柠檬烯最低抑菌浓度从亲本的69 mg/L提升至122–145 mg/L，相对适应度最高达10.9倍。通过基因组重建，首次鉴定出单个TCB3截短突变tTcb3p1-989即足以恢复进化表型，使柠檬烯适应度提高9倍，而完全敲除TCB3无此效果。该突变还能使β-蒎烯适应度提高11倍、月桂烯提高8倍、喷气燃料混合物AMJ-700t提高4倍，但对对伞花烃无改善。机制解析表明，tTcb3p1-989通过维持细胞壁完整性发挥作用：柠檬烯暴露后，突变株受损细胞仅从11%增至24%，而亲本从6%激增至59%；突变株在胁迫下的差异表达基因仅29个，远少于亲本的453个。该工作揭示了tricalbin蛋白在细胞壁调控中的新功能，为高毒性萜类燃料前体的微生物生产提供了简单有效的耐受性工程策略。
创新点
首次报道单个点突变（TCB3截短tTcb3p1-989）即可赋予酵母对多种单萜及喷气燃料混合物（AMJ-700t）的耐受性；利用时间序列全基因组重测序精准筛选重要突变，避免最终菌株中乘客突变的干扰；揭示tricalbin蛋白（Tcb3p）在细胞壁完整性调控中的新功能，为相毒性工程改造提供了首个成功案例。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae S288C | 甲羟戊酸途径（背景） | TCB3 | Tcb3p（tTcb3p1-989） | 区室化 | 内质网-质膜锚定蛋白（tricalbin），截短至989氨基酸的突变增强柠檬烯耐受性 |
| Saccharomyces cerevisiae S288C | — | TCB2 | Tcb2p | 区室化 | 与Tcb3p形成异源复合物，敲除TCB2也提高柠檬烯耐受性（fitness 7.86±1.27） |
| Saccharomyces cerevisiae S288C | 多效药物抗性网络 | PDR3 | Pdr3p | 调控 | 转录激活因子，所有进化菌株均携带Q763L突变，但单独重建无显著表型 |
| Saccharomyces cerevisiae S288C | 细胞壁完整性信号通路 | ECL1, SMP1, TIR2, YPL277C, YGP1, FIT2, FIT3, SIT1, HMX1, ARN1, FRE5, TIS11 | — | 调控 | tTcb3p1-989菌株在柠檬烯胁迫下上调的基因，与细胞壁维持和铁离子稳态相关 |
| Saccharomyces cerevisiae S288C | 细胞壁蛋白 | — | Plb2p, Cis3p, Ccw14p, Gas3p, Yap7p, Cwp1p, Ygp1p | 调控 | 细胞壁蛋白组分析，突变株在柠檬烯胁迫下诱导的细胞壁蛋白 |
关键发现
- 亲本S288C的柠檬烯MIC为69 mg/l，进化菌株MIC为122-145 mg/l，提高1.8-2.1倍
- 相对fitness至少提高9倍，最高fitness为10.9±1.6（TB302，120代）
- 基因组重建表明TCB3截短突变（tTcb3p1-989）单独即足以恢复进化表型，使柠檬烯fitness提高9倍，而TCB3完全敲除无作用
- tTcb3p1-989使β-蒎烯fitness提高11倍、月桂烯提高8倍、AMJ-700t（10%对伞花烃、50%柠檬烯、40%法尼烯）提高4倍，但对对伞花烃及芳香族化合物无改善
- TCB2敲除（Δtcb2）fitness为7.86±1.27
- 细胞壁损伤实验显示，柠檬烯暴露后S288C有59±6%细胞受损（对照6±1%），而tTcb3p1-989突变株仅从11±1%增至24±1%
- 突变株在柠檬烯胁迫下差异表达基因仅29个，而S288C有453个。
研究结论
通过适应性进化结合全基因组重测序，成功鉴定出TCB3截短突变tTcb3p1-989是赋予酵母柠檬烯耐受性的关键增益型突变，该突变通过维持细胞壁完整性提高对多种单萜和喷气燃料混合物的耐受性，为酵母中高毒性C10烯烃的商业化生产提供了简单有效的耐受性工程策略。