Altered Regulation of 15-Acetyldeoxynivalenol Production in Fusarium graminearum
- 作者
- LIFENG CHEN, SUSAN P. MCCORMICK, THOMAS M. HOHN
- 单位
- Department of Plant Pathology, Nanjing Agricultural University, Nanjing, China; Mycotoxin Research Unit, National Center for Agricultural Utilization Research, USDA Agricultural Research Service, Peoria, Illinois 61604
- 杂志
- Applied and Environmental Microbiology（2000）
- DOI
- 10.1128/AEM.66.5.2062-2065.2000
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）在液体摇瓶培养条件下产生极低或无法检测的单端孢霉烯毒素，难以进行其生物合成的生化研究和大规模制备。
研究策略
通过向F. graminearum转化含同源TRI5启动子（FGTR15P）的报告基因（GUS）及/或异源转录因子FSTR16（来自Fusarium sporotrichioides）的质粒，利用同源重组将载体整合至基因组TRI5启动子位点，以改变通路基因的表达调控并提高15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇（15-ADON）的产量。
核心内容
禾谷镰刀菌在液体摇瓶培养条件下合成单端孢霉烯毒素的能力极低，严重制约了相关生化研究与毒素制备。该工作通过向禾谷镰刀菌GZ3639菌株转化携带同源TRI5启动子序列的报告基因或异源转录因子FSTR16的质粒，利用同源重组将载体整合至基因组TRI5启动子位点以重塑通路调控。研究发现，仅质粒整合即可提升15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇产量，而将FSTR16靶向整合于TRI5位点时协同作用最为显著，7天摇瓶培养产量高达1200 mg/L，约为其他整合位点转化子的20倍，相比野生型菌株不足5 mg/L的产量提升超过两个数量级。进一步分析显示，靶向整合菌株的报告基因活性较非靶向整合菌株高约100倍，且表达不随时间明显波动，提示通路基因可能转为组成型表达。该策略证实TRI6功能在镰刀菌属间保守，为单端孢霉烯毒素的大规模制备提供了可行途径，也为通过操作转录因子表达改善丝状真菌次级代谢产物产量提供了范例。
创新点
发现质粒经TRI5启动子序列同源整合至基因组TRI5位点本身即可提升液体摇瓶培养中的15-ADON产量；在此基础上导入异源FSTR16基因并定位整合于TRI5位点可协同作用，使产量提高约20倍。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Fusarium graminearum GZ3639 | trichothecene biosynthesis pathway | TRI5 | trichodiene synthase | 催化 | 编码单端孢霉烯生物合成途径的第一个酶，其启动子被用作同源重组靶点以改变产物调控。 |
| Fusarium graminearum GZ3639 | trichothecene biosynthesis pathway | TRI6 | TRI6 transcription factor | 调控 | 来自Fusarium sporotrichioides的异源C2H2型锌指转录因子，导入并整合于TRI5启动子位点时使15-ADON产量大幅提高。 |
| Fusarium graminearum GZ3639 | trichothecene biosynthesis pathway | GUS | beta-D-glucuronidase | 催化 | 作为报告基因，用于监测TRI5启动子驱动的基因表达，其在定位整合于TRI5位点的B4-1转化子中活性极高。 |
关键发现
- 野生型菌株GZ3639在GYEP液体摇瓶培养7天后15-ADON产量低于5 mg/L
- 携带FGTR15P-GUS报告基因的pProm5GUS-11转化子中，D1-2、D6-2和D8-3产生25~225 mg/L（摘要中为45~200 mg/L）的15-ADON，而D4-1和亲本低于5 mg/L。仅含FGTR15P的pProm5转化子G11-1产生50~75 mg/L，G15-1低于5 mg/L。引入FSTR16后，无论整合位点如何（B9-1、C11-1、G11-1）在7天时平均产量均为47~54 mg/L，而整合于TRI5位点的B4-1产量高达1200 mg/L，约为其他转化子的20倍。B4-1的GUS活性比B9-1高约100倍（B9-1仅为B4-1的1%~2%），且GUS表达不随时间明显变化，提示通路基因表达可能为组成型。
研究结论
通过将异源FSTR16基因靶向整合至TRI5启动子位点，可显著提高禾谷镰刀菌在液体摇瓶培养中的15-ADON产量（最高达1200 mg/L），为单端孢霉烯毒素的大量制备提供了便捷方法，同时证明TRI6功能在镰刀菌属间保守，并提示通过操作TRI6表达可改善其他真菌的毒素产量。