Cloning and Characterization of the xyl1 Gene, Encoding an NADH-Preferring Xylose Reductase from Candida parapsilosis, and Its Functional Expression in Candida tropicalis
- 作者
- Jung-Kul Lee, Bong-Seong Koo, Sang-Yong Kim
- 单位
- BioNgene Co., Ltd., Jongro-Ku, Seoul 110-521, Korea; Bolak Co., Ltd., Hwasung-Si, Kyungki-Do 445-930, Korea
- 杂志
- Applied and Environmental Microbiology（2003）
- DOI
- 10.1128/AEM.69.10.6179-6188.2003
- 所属领域
- 代谢工程 / 发酵工程
- 关键词
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解决的核心问题
多数木糖还原酶（XR）依赖NADPH，受辅酶供应限制，导致木糖醇生产效率低并积累副产物；急需获得偏好NADH的XR以改善木糖醇工业发酵。
研究策略
从Candida parapsilosis中克隆并表征一个NADH偏好的木糖还原酶基因xyl1，将其整合到Candida tropicalis基因组中，在ADH启动子控制下实现功能表达，评估重组菌的木糖醇发酵性能。
核心内容
本研究从Candida parapsilosis中克隆并表征了编码NADH偏好型木糖还原酶的xyl1基因。该酶为36.6 kDa亚基的同源二聚体，对D-木糖的Km为31.5 mM，催化效率kcat/Km为1.46 s⁻¹ mM⁻¹；在辅酶特异性上，其对NADH的Km为3.3 μM，催化效率达1.39×10⁴ s⁻¹ mM⁻¹，远高于对NADPH的1.27×10² s⁻¹ mM⁻¹，显著区别于已知的醛糖还原酶。酶反应遵循顺序有序Bi Bi机制，木糖醇抑制常数Ki为368 mM。将该基因置于ADH启动子控制下整合入工业木糖醇生产菌Candida tropicalis基因组，重组菌BN-1同时检测到NADH和NADPH依赖的XR活性，证实功能表达。以木糖为底物发酵时，木糖醇产量较野生型提高5%，生产率提高25%，产率达91.6%（wt/wt），生产率为5.09 g/L/h，同时副产物乙醇和甘油积累显著降低。结果表明NADH偏好型XR能有效缓解辅酶供应限制，为工业木糖醇生产提供了更优的酶元件和菌株。
创新点
['首次克隆并表征了NADH偏好型木糖还原酶基因xyl1', '揭示了C. parapsilosis XR在辅酶特异性上不同于已知醛糖还原酶（NADH效率远高于NADPH）', '将NADH偏好型xyl1在工业木糖醇生产菌C. tropicalis中成功功能表达，提高产量和生产率的', '重组菌降低了副产物乙醇和甘油的积累，简化了木糖醇纯化']
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Candida parapsilosis KFCC-10875 | D-木糖代谢途径（D-木糖→木糖醇） | xyl1 | 木糖还原酶（XR） | 催化 | NADH偏好型木糖还原酶的基因来源菌株 |
| Candida tropicalis KFCC-10960 | D-木糖代谢途径（D-木糖→木糖醇） | — | — | 催化 | 木糖醇生产宿主菌，用于xyl1基因表达 |
| Escherichia coli MC1061 | — | xyl1 | — | 催化 | 基因克隆宿主 |
| Candida tropicalis BN-1 | D-木糖代谢途径（D-木糖→木糖醇） | xyl1（来源于C. parapsilosis） | 木糖还原酶（XR） | 催化 | 整合表达C. parapsilosis xyl1的重组菌，具有NADH/NADPH双辅酶特异性 |
| Candida tropicalis KFCC-10960 | D-木糖代谢途径 | ADH1启动子 | — | 调控 | 用于驱动xyl1基因表达的组成型启动子 |
关键发现
- ['C. parapsilosis XR亚基分子量36.6 kDa，天然分子量69.0 kDa，为同源二聚体', '对D-木糖的Km为31.5 mM，催化效率kcat/Km=1.46 s^-1 mM^-1', '辅酶偏好NADH：Km=3.3 μM，kcat/Km=1.39×10^4 s^-1 mM^-1
- NADPH：Km=36.5 μM，kcat/Km=1.27×10^2 s^-1 mM^-1', '纯化过程达到47.9倍纯化，比活41.7 U/mg，回收率8.9%', '重组菌C. tropicalis BN-1以木糖为底物时木糖醇产量较野生型提高5%，生产率提高25%，木糖醇产率91.6%（wt/wt），生产率5.09 g/L/h，同时乙醇和甘油产量显著降低', 'C. tropicalis BN-1中同时检测到NADH和NADPH依赖的XR活性（NADH比活0.58 U/mg，NADPH比活0.53 U/mg），证实xyl1功能表达', 'C. parapsilosis XR反应遵循顺序有序Bi Bi机制，木糖醇抑制常数Ki=368 mM，NAD+对NADH竞争性抑制Ki=180 μM']
研究结论
本研究克隆并表达了C. parapsilosis的NADH偏好型木糖还原酶基因xyl1，在C. tropicalis中功能表达后可提高木糖醇产量和生产率，同时减少副产物积累，为工业木糖醇生物生产提供了更优的酶和菌株。