Cofactor specificity of the bifunctional alcohol and aldehyde dehydrogenase (AdhE) in wild-type and mutants of Clostridium thermocellum and Thermoanaerobacterium saccharolyticum
- 作者
- Tianyong Zheng, Daniel G. Olson, Liang Tian, Yannick J. Bomble, Michael E. Himmel, Jonathan Lo, Shuen Hon, A. Joe Shaw, Johannes P. van Dijken, Lee R. Lynd
- 单位
- Department of Biological Sciences, Dartmouth College; Thayer School of Engineering, Dartmouth College; Biosciences Center, National Renewable Energy Laboratory; Novogy Inc.; Delft University of Technology; BioEnergy Science Center
- 杂志
- Journal of Bacteriology（2015）
- DOI
- 10.1128/JB.00232-15
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解析野生型及突变菌株中双功能醇/醛脱氢酶AdhE的辅因子特异性变化规律，阐明辅因子偏好由NADH转向NADPH与乙醇产量提升的关系，并解释C. thermocellum乙醇产量低于T. saccharolyticum的原因。
研究策略
将来自6个菌株的adhE基因克隆并在E. coli中表达，经亲和纯化后测定ALDH和ADH活性及辅因子特异性；将D494G和G544D等点突变重新引入C. thermocellum和T. saccharolyticum验证其对乙醇产量的影响；通过同源建模与分子动力学模拟解析突变改变辅因子特异性的结构基础。
研究路线图
核心内容
本研究通过在大肠杆菌中异源表达并亲和纯化来自多个菌株的双功能醇/醛脱氢酶AdhE，系统解析了野生型及突变体中辅因子特异性的变化规律及其与乙醇产量的关系。酶活测定显示，野生型C. thermocellum和T. saccharolyticum的AdhE均以NADH为偏好辅因子，而高产乙醇菌株的AdhE辅因子偏好显著转向NADPH，例如T. saccharolyticum LL1049的ADH以NADPH活性为主（12.70 U/mg vs NADH 0.66 U/mg）。动力学分析表明，C. thermocellum LL350的D494G突变使ADH对NADPH的催化效率达3.7×10⁶ M⁻¹s⁻¹，与野生型NADH活性相当，同时NADH催化效率降至1.3×10⁶ M⁻¹s⁻¹；结构建模揭示该突变通过解除天冬氨酸残基对NADPH 2'-磷酸基团的静电排斥而改变辅因子选择性。将D494G引入C. thermocellum后乙醇产量提高1.7倍（0.24 vs 0.14 g/g纤维二糖），将G544D引入T. saccharolyticum后产量提高1.5倍（0.32 vs 0.21 g/L）。此外，乙醇耐受突变体LL346的AdhE并未改变辅因子特异性，而是通过降低酶活性实现耐受。这些结果阐明了AdhE辅因子偏好转变是提高乙醇产量的关键机制，为定向改造该酶提供了分子基础。
创新点
['通过亲和纯化AdhE蛋白，排除了细胞提取物中其他醇脱氢酶的干扰，首次明确多种突变对AdhE辅因子特异性的具体影响', '发现C. thermocellum LL350的D494G突变使ADH同时具备NADH和NADPH活性，且NADPH活性与野生型NADH活性相当', '揭示乙醇耐受菌株LL346的AdhE突变并未改变辅因子特异性而是降低酶活性，修正了此前基于细胞提取物的结论', "通过结构建模阐明Asp-494与NADPH 2'-磷酸基团的静电排斥决定辅因子选择性的分子机制"]
研究对象（9）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Clostridium thermocellum LL1004 (wild-type) | 乙醇发酵途径（乙酰-CoA→乙醛→乙醇） | adhE | AdhE（双功能醇/醛脱氢酶） | 催化 | 野生型，NADH偏好，纯化ADH NADH活性42.23 U/mg，ALDH NADH活性18.02 U/mg |
| Clostridium thermocellum LL350 (Δhpt ΔhydG) | 乙醇发酵途径 | adhE (D494G) | AdhE D494G突变体 | 催化 | D494G突变使ADH同时获得NADH和NADPH活性（42.67和42.30 U/mg），ALDH仍偏好NADH，乙醇产量0.22 g/g纤维二糖 |
| Clostridium thermocellum LL346 (adhE*) | 乙醇发酵途径 | adhE (P704L, H734R) | AdhE P704L/H734R突变体 | 催化 | 乙醇耐受菌株，纯化后仍以NADH为辅因子（ADH NADH 4.02 U/mg），实际降低酶活性，对NAD+和乙醇抑制不敏感 |
| Thermoanaerobacterium saccharolyticum LL1025 (wild-type) | 乙醇发酵途径 | adhE | AdhE | 催化 | 野生型，NADH偏好，ADH NADH活性17.43 U/mg，ALDH NADH活性10.63 U/mg |
| Thermoanaerobacterium saccharolyticum LL1049 | 乙醇发酵途径 | adhE (G544D) | AdhE G544D突变体 | 催化 | 高乙醇生产菌株，辅因子转为NADPH偏好，ADH NADPH活性12.70 U/mg，ALDH NADPH活性11.13 U/mg |
| Thermoanaerobacterium saccharolyticum LL1040 (ALK2) | 乙醇发酵途径 | adhE (V52A, K451N, 13个氨基酸插入) | AdhE多重突变体 | 催化 | 高乙醇生产菌株，ADH和ALDH均转为NADPH偏好，ADH NADPH活性12.96 U/mg，ALDH NADPH活性5.03 U/mg |
| Escherichia coli (表达宿主) | 异源蛋白表达 | adhE（来自各菌株） | His标记的AdhE | 催化 | 用于AdhE的克隆表达、亲和纯化及酶活测定，阴性对照活性<0.4 U/mg |
| Thermoanaerobacterium saccharolyticum | 乙醇发酵途径（推测的替代ADH） | Tsac_2087 (adhA) | AdhA（NADPH连接的伯醇脱氢酶） | 催化 | 与T. mathranii和T. ethanolicus AdhA有86%蛋白序列一致性，可能负责LL1040/LL1049细胞提取物中主要的NADPH-ADH活性 |
| Clostridium thermocellum / Thermoanaerobacterium saccharolyticum | 还原力供给（NADPH生成） | nfnAB | NfnAB复合体 | 能量供给 | 催化2 NADP+ + NADH + 还原型铁氧还蛋白 → 2 NADPH + NAD+ + 氧化型铁氧还蛋白，可能为NADPH依赖的乙醇合成提供还原力 |
关键发现
- 纯化AdhE实验表明：野生型C. thermocellum LL1004的ADH活性以NADH为主（42.23±3.13 U/mg vs NADPH
- 96±1.25 U/mg），ALDH亦为NADH偏好（18.02±2.45 vs
- 03±0.46）；野生型T. saccharolyticum LL1025的ADH NADH活性17.43±2.45、NADPH
- 43±2.43。高产乙醇菌株T. saccharolyticum LL1049的ADH活性转为NADPH主导（12.70±2.18 vs NADH
- 66±1.97），ALDH亦偏好NADPH（11.13±1.35 vs NADH
- 63±0.30）；LL1040的ADH NADPH活性12.96±4.54、NADH几乎为零。C. thermocellum LL350的D494G突变使ADH NADPH活性升至42.30±4.28 U/mg，与NADH活性（42.67±7.46）相当，而ALDH仍以NADH为主（31.50±5.80 vs
- 76±0.16）。动力学显示D494G突变体对NADPH的Km为0.075 mM、kcat 280 s⁻¹、催化效率3.7×10⁶ M⁻¹s⁻¹，与野生型NADH活性无显著差异；NADH催化效率则从3.0×10⁶降至1.3×10⁶ M⁻¹s⁻¹（p<0.05）。将D494G引入C. thermocellum（LL1161）后乙醇产量达0.24 g/g纤维二糖，较对照LL1160（0.14 g/g）提高1.7倍；将G544D引入T. saccharolyticum（LL1194）后乙醇产量0.32 g/L，较对照LL1193（0.21 g/L）提高1.5倍。LL346 AdhE在1 M乙醇存在下ADH活性提高2倍，且在2.35 mM NAD⁺存在下保留98% ADH活性（其他AdhE平均仅30%）。
研究结论
AdhE辅因子特异性由NADH向NADPH的转变与C. thermocellum和T. saccharolyticum的乙醇产量提高相关；D494G和G544D单点突变足以部分提高乙醇产量，其机制是解除天冬氨酸对NADPH 2'-磷酸基团的排斥，允许NADPH进入ADH结构域结合口袋；而LL346的乙醇耐受突变则主要通过降低AdhE活性而非改变辅因子特异性起作用。