The TetR family transcriptional regulator PccD negatively controls propionyl coenzyme A assimilation in Saccharopolyspora erythraea
- 作者
- Zhen Xu, Miaomiao Wang, Bang-Ce Ye
- 单位
- Lab of Biosystems and Microanalysis, State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China; School of Chemistry and Chemical Engineering, Shihezi University, Xinjiang 832000, China
- 杂志
- Journal of Bacteriology（2017）
- DOI
- 10.1128/JB.00281-17
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
在Saccharopolyspora erythraea中，丙酰辅酶A是红霉素生物合成的起始单位，其同化为甲基丙二酰辅酶A的前体供应受转录调控的机制尚不明确；需要鉴定调控因子以增加红霉素产量。
研究策略
通过qRT-PCR筛选对丙醇/丙酸盐响应的丙酰辅酶A羧化酶基因座；结合凝胶迁移实验(EMSA)与DNase I足迹法验证PccD直接结合；通过基因敲除/过表达分析表型与转录水平；检测胞内丙酰辅酶A/甲基丙二酰辅酶A浓度及红霉素产量。
研究路线图
核心内容
该研究以红霉素生产菌株Saccharopolyspora erythraea为对象，探究丙酰辅酶A同化为甲基丙二酰辅酶A的转录调控机制。通过qRT-PCR筛选、凝胶迁移实验和DNase I足迹法，鉴定出TetR/AcrR家族调控因子PccD，它直接结合pccBC和pccA启动子并负调控丙酰辅酶A羧化酶基因簇的转录。敲除pccD使pccA和pccBC转录分别上调15倍和37倍，而过表达则使其下调3倍。同时发现甲基丙二酸是PccD的效应分子，可抑制其与DNA结合，10 mM甲基丙二酸能使pccBC转录升高超过26倍。在含正丙醇的培养基中，ΔpccD菌株胞内丙酰辅酶A浓度降低、甲基丙二酰辅酶A升高，红霉素产量显著高于野生型。该发现明确了丙酰辅酶A同化受PccD负调控的分子机制，敲除pccD为增强前体供应、提高红霉素产量提供了有效代谢工程策略。
创新点
首次鉴定TetR/AcrR家族调控因子PccD为丙酰辅酶A羧化酶基因簇pccBC/pccA的负调控因子；证明甲基丙二酸是PccD的效应分子并与丙酰辅酶A同化及红霉素生物合成偶联；ΔpccD菌株可用作提高红霉素产量的代谢工程策略。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharopolyspora erythraea NRRL2338 | 丙酰辅酶A同化（PCC途径） | pccB (SACE_3398) | PccB（丙酰辅酶A羧化酶β亚基） | 催化 | 含羧基转移酶(CT)活性，与PccC/PccA共同催化丙酰辅酶A羧化 |
| Saccharopolyspora erythraea NRRL2338 | 丙酰辅酶A同化（PCC途径） | pccC (SACE_3399) | PccC（丙酰辅酶A羧化酶ε亚基） | 催化 | 与pccB共转录形成pccBC操纵子 |
| Saccharopolyspora erythraea NRRL2338 | 丙酰辅酶A同化（PCC途径） | pccA (SACE_3400) | PccA（丙酰辅酶A羧化酶α亚基） | 催化 | 含生物素羧化酶(BC)和生物素羧基载体蛋白(BCCP)结构域 |
| Saccharopolyspora erythraea NRRL2338 | 丙酰辅酶A同化（PCC途径） | pccD (SACE_3396) | PccD（TetR/AcrR家族转录调控因子） | 调控 | 负调控pccBC和pccA；甲基丙二酸为其效应分子 |
| Escherichia coli Rosetta(DE3) | — | pccD | 重组His-PccD | 调控 | 异源表达用于纯化PccD蛋白并进行EMSA/DNase I footprint分析 |
关键发现
- 添加正丙醇或丙酸盐使丙酰辅酶A羧化酶基因座SACE_3398-3400的转录水平提高4–16倍（pccBC为4倍/14倍，pccA为5倍/16倍）
- 敲除pccD使pccA与pccBC转录分别上调15倍和37倍，而pccD过表达菌株（约5倍过表达）使两操纵子转录下调3倍
- 10 mM甲基丙二酸使pccBC转录水平升高超过26倍
- DNase I足迹法确定PccD保护pccBC启动子-140至-114的27 nt区域，预测结合基序为(t/a)TGACG(g/c)TG(t/c)TG(t/a)
- EMSA显示甲基丙二酸抑制PccD与DNA结合，而丙酸盐、丙酰辅酶A、甲基丙二酰辅酶A和琥珀酰辅酶A无此作用
- 在丙酸钠为唯一碳源的Evans培养基上，ΔpccD菌株生长速率高于野生型，WT/PIB-pccD菌株则受抑
- 在含1%正丙醇的TSB中，ΔpccD菌株胞内丙酰辅酶A浓度降低、甲基丙二酰辅酶A浓度升高，红霉素产量显著高于野生型。
研究结论
PccD通过直接结合pccBC和pccA启动子负调控丙酰辅酶A羧化酶，抑制丙酰辅酶A向甲基丙二酰辅酶A的同化，从而限制红霉素前体供应；敲除pccD可增强丙酰辅酶A同化并提高红霉素产量，为工业菌株代谢工程改造提供新靶点。