Dihydrolipoamide Dehydrogenase Mutation Alters the NADH Sensitivity of Pyruvate Dehydrogenase Complex of Escherichia coli K-12
- 作者
- Youngnyun Kim, L. O. Ingram, K. T. Shanmugam
- 单位
- Department of Microbiology and Cell Science, University of Florida, Gainesville, Florida 32611
- 杂志
- Journal of Bacteriology（2008）
- DOI
- 10.1128/JB.00104-08
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
野生型大肠杆菌在厌氧条件下，丙酮酸脱氢酶复合物（PDH）因受NADH反馈抑制而活性极低，导致在敲除ldhA和pflB后无法厌氧生长；需要解除NADH抑制以利用PDH产生额外NADH合成乙醇。
研究策略
从ldhA pflB双缺失突变体中筛选厌氧生长且产乙醇的突变体，通过DNA测序定位lpd基因突变；纯化野生型和突变型LPD及PDH复合物，测定酶动力学参数；利用基因转导和质粒互补验证突变功能。
研究路线图
核心内容
该研究针对大肠杆菌厌氧条件下丙酮酸脱氢酶复合物（PDH）因受NADH反馈抑制而活性极低、无法在敲除ldhA和pflB后生长的问题，从ldhA pflB双缺失突变体AH242中筛选获得6个可厌氧生长并产乙醇的突变体。DNA测序显示所有突变均位于lpd基因，分别为H322Y和E354K两种氨基酸替换。酶动力学分析表明，这两个突变使PDH复合物对NADH的K_i从野生型的1.0μM分别提高到9.6μM和10.0μM，约提升10倍；纯化的LPD(E354K)在0.14mM NADH存在下仍保持75%左右活性，而野生型完全失活。在厌氧发酵中，代表性突变株SE2378乙醇产量达107.3mM，约为野生型W3110的15倍，且几乎不产生乳酸和甲酸等副产物。尽管突变体PDH的Vmax有所下降，但对NADH敏感性的显著降低使其在厌氧条件下持续发挥功能。该工作首次证明通过LPD点突变解除NADH反馈抑制，即可实现无需外源基因的同型乙醇发酵，为代谢工程改造提供新策略。
创新点
首次发现lpd基因的H322Y和E354K两个氨基酸替换可显著降低LPD及PDH复合物对NADH的敏感性（K_i提高约10倍），使PDH在厌氧条件下保持活性，实现无需外源基因的同型乙醇发酵。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli K-12 | 丙酮酸脱氢酶复合物（PDH）途径 | lpd | 二氢硫辛酰胺脱氢酶（LPD） | 催化 | PDH复合物的E3组分；突变H322Y（lpd102）和E354K（lpd101）降低NADH敏感性 |
| Escherichia coli K-12 | 丙酮酸脱氢酶复合物（PDH）途径 | aceE | 丙酮酸脱氢酶（E1） | 催化 | PDH复合物的E1组分，基因转录水平在有氧/厌氧条件下均不受氧气影响 |
| Escherichia coli K-12 | 丙酮酸脱氢酶复合物（PDH）途径 | aceF | 二氢硫辛酰胺乙酰转移酶（E2） | 催化 | PDH复合物的E2组分 |
| Escherichia coli K-12 | 乙醇发酵途径 | adhE | 酒精/乙醛脱氢酶 | 催化 | 将乙酰辅酶A还原为乙醇，利用PDH产生的NADH |
| Escherichia coli K-12 | 乳酸发酵途径 | ldhA | 乳酸脱氢酶 | 催化 | 突变体背景中敲除，消除乳酸产生 |
| Escherichia coli K-12 | 甲酸发酵途径 | pflB | 丙酮酸甲酸裂解酶 | 催化 | 突变体背景中敲除，消除甲酸产生 |
| Escherichia coli K-12 | PDH操纵子调控 | pdhR | PdhR调控蛋白 | 调控 | PDH操纵子的转录调控因子，在SE2378中除lpd突变外还携带pdhR突变 |
关键发现
- 从E. coli ldhA pflB双缺失突变体（AH242）中筛选到6个厌氧生长且产乙醇的突变体，所有突变均位于lpd基因：3株为lpd102（H322Y），3株为lpd101（E354K）。这些突变使PDH复合物对NADH的K_i从野生型的1.0μM提高到9.6μM（H322Y）和10.0μM（E354K），约10倍。纯化的LPD(E354K)在0.14mM NADH存在下（2mM NAD+时）仅被抑制约25%，而野生型LPD在此条件下完全失活。在厌氧发酵中，代表性突变株SE2378（lpd101）乙醇产量达107.3mM，乙酸4.7mM，甲酸0mM，而野生型W3110产生乙醇7.3mM、乙酸9.3mM、乳酸18.5mM
- LPD突变使乙醇产量提高约15倍（107.3 vs 7.3），并几乎消除了副产物。另外，LPD(E354K)在反向反应中仅需20μM NAD+即可完全激活，而野生型需150μM（7.5倍差异）。PDH复合物动力学显示突变体Vmax有所降低（H322Y为26.7，E354K为30.3 μmol/min/mg，野生型为46.6），但NADH敏感性大幅下降。
研究结论
LPD突变解除了NADH对PDH复合物的反馈抑制，使得大肠杆菌在厌氧条件下可通过PDH产生额外NADH并驱动同型乙醇发酵，为代谢工程提供新策略。