Depletion of undeacpenyl pyrophosphate phosphatases (UPP- Pases) disrupts cell envelope biogenesis in Bacillus subtilis
- 作者
- Heng Zhao, Yingjie Sun, Jason M. Peters, Carol A. Gross, Ethan C. Garner, John D. Helmann
- 单位
- Cornell University, Department of Microbiology, Ithaca, NY, USA; Harvard University, Molecular and Cellular Biology Department and Faculty of Arts and Sciences (FAS) Center for Systems Biology, Cambridge, MA, USA; University of California, San Francisco, Department of Microbiology and Immunology, CA, USA
- 杂志
- Journal of Bacteriology（2017）
- DOI
- 10.1128/JB.00507-16
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
鉴定枯草芽孢杆菌中UPP磷酸酶（UPP-Pase）的功能冗余性，并阐明其缺失对细胞被膜生物合成的影响。
研究策略
利用优化的CRISPRi系统（双拷贝dCas9、双sgRNA）对候选UPP-Pase基因进行条件性转录抑制，结合基因敲除、全基因组测序、生长与形态学分析、转录组分析等方法。
研究路线图
核心内容
该研究利用优化的CRISPRi系统鉴定枯草芽孢杆菌中十一异戊二烯焦磷酸磷酸酶（UPP-Pase）的功能冗余性。作者通过双拷贝dCas9和双sgRNA策略同时抑制uppP与bcrC，发现二者构成合成致死基因对，均无法单独维持细胞存活，而过表达yodM可挽救双突变体。优化后的CRISPRi系统将抑制子突变频率降低了约10倍。在2%木糖诱导耗竭条件下，起始OD600为0.14的菌株最终仅达约0.7（葡萄糖对照约1.2），且接种量每稀释2倍最终OD降低约2倍，表明3-4代内BcrC即被耗尽。耗竭约200分钟后细胞开始膨出，初期约10%细胞宽度超过1.2微米，180分钟达峰。部分耗竭株对杆菌肽和达托霉素敏感性显著增加。转录组分析显示超过150个基因上调3倍以上，σM调节子被诱导。该工作证明UppP和BcrC是枯草芽孢杆菌中功能冗余的必需酶，其耗竭破坏细胞被膜生物合成并触发σM依赖的应激反应，揭示细胞被膜稳态与σM调节子间的紧密关联。
创新点
优化了CRISPRi系统以减少抑制子突变频率；首次证明UppP和BcrC是枯草芽孢杆菌中功能冗余的必需UPP-Pase；发现YodM过表达可替代其功能；揭示UPP-Pase耗竭触发σM依赖的细胞被膜应激反应。
研究对象（10）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Bacillus subtilis | 细胞被膜生物合成（肽聚糖和壁磷壁酸） | uppP | UppP | 催化 | 预测的UPP磷酸酶，与BcrC功能冗余 |
| Bacillus subtilis | 细胞被膜生物合成（肽聚糖和壁磷壁酸） | bcrC | BcrC | 催化 | UPP磷酸酶，受σM调控 |
| Bacillus subtilis | 细胞被膜生物合成（肽聚糖和壁磷壁酸） | yodM | YodM | 催化 | 推定脂磷酸酶，过表达可替代UppP/BcrC |
| Bacillus subtilis | 十一异戊二烯磷酸（Und-P）循环 | uppS | UppS | 催化 | 合成UPP的酶 |
| Bacillus subtilis | CRISPRi转录抑制 | dCas9 (来自Streptococcus pyogenes) | dCas9 | 调控 | 用于CRISPRi的催化失活Cas9，条件性抑制靶基因 |
| Bacillus subtilis | 细胞被膜应激反应 | sigM | σM因子 | 调控 | 细胞被膜应激反应调节子，调控bcrC等基因 |
| Bacillus subtilis | 肽聚糖合成 | murJ | MurJ | 转运 | 脂质II翻转酶 |
| Bacillus subtilis | 肽聚糖合成 | amj | Amj | 转运 | 应激诱导的脂质II翻转酶，与MurJ功能冗余 |
| Bacillus subtilis | 肽聚糖合成 | mraY | MraY | 催化 | 合成脂质I |
| Bacillus subtilis | 壁磷壁酸合成 | tagO | TagO | 催化 | 壁磷壁酸合成起始酶 |
关键发现
- bcrC与uppP构成合成致死基因对，无法构建双突变体，但过表达yodM可拯救双突变体存活。CRISPRi同时抑制bcrC和uppP导致木糖敏感性，出现抑菌圈
- 弱sgRNA效果较弱。优化系统（双拷贝dCas9、双sgRNA、ΔyodM）将抑制子频率降低约10倍。在2%木糖条件下，起始OD600=0.14的耗竭株最终OD600约0.7（葡萄糖对照约1.2）
- 起始接种量每稀释2倍，最终OD降低约2倍，表明3-4代内BcrC耗尽。耗竭后约200分钟细胞开始出现膨出，初始约10%细胞宽度>1.2 μm，120分钟后显著增加，180分钟达峰。部分耗竭株对杆菌肽和达托霉素敏感性显著增加(P<0.01)，对万古霉素和磷霉素中等增加(P<0.05)。转录组分析显示>150个基因上调>3倍，~300个基因下调>3倍
- σM调节子被诱导。抑制子全基因组测序表明10个中有9个为dCas9移码突变，1个为bcrC的PAM位点突变。
研究结论
枯草芽孢杆菌需要UppP或BcrC任一UPP-磷酸酶维持生存，二者功能冗余；YodM在过表达时也能支持生长。UPP-Pase缺失破坏细胞被膜生物合成并激活σM依赖的应激反应，表明σM调节子与细胞被膜稳态密切相关。