Biosynthetic Pathway for γ-Cyclic Sarcinaxanthin in Micrococcus luteus: Heterologous Expression and Evidence for Diverse and Multiple Catalytic Functions of C50 Carotenoid Cyclases
- 作者
- Roman Netzer, Marit H. Stafsnes, Trygve Andreassen, Audun Goksøyr, Per Bruheim, Trygve Brautaset
- 单位
- SINTEF Materials and Chemistry, Department of Biotechnology, Sem Selands vei 2a, NO-7465 Trondheim, Norway; Department of Biotechnology, Norwegian University of Science and Technology, Sem Selands vei 6/8, NO-7491 Trondheim, Norway; Promar AS, Snarøyveien 57, 1367 Snarøya, Norway
- 杂志
- Journal of Bacteriology（2010）
- DOI
- 10.1128/JB.00724-10
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解析藤黄微球菌（Micrococcus luteus）中γ-环状C50类胡萝卜素sarcinaxanthin的生物合成基因簇与途径，并阐明C50类胡萝卜素环化酶的多重催化功能，以实现其在非类胡萝卜素宿主中的高效异源生产。
研究策略
克隆M. luteus NCTC2665和海洋分离株Otnes7的sarcinaxanthin生物合成基因簇，通过在大肠杆菌中表达完整或部分基因簇、构建杂合基因簇，结合LC-MS和NMR分析中间产物与终产物，逐步解析途径并评估不同基因来源的产量差异。
研究路线图
核心内容
本研究克隆并解析了藤黄微球菌（Micrococcus luteus）NCTC2665与海洋分离株Otnes7中γ-环状C50类胡萝卜素sarcinaxanthin的完整生物合成基因簇（crtE、crtB、crtI、crtE2、crtYg、crtYh、crtX），通过在大肠杆菌中表达完整或部分基因簇并结合LC-MS与NMR分析中间产物，逐步阐明了从FPP经lycopene、nonaflavuxanthin、flavuxanthin到sarcinaxanthin的合成途径。结果显示，crtE2编码的番茄红素延长酶可将lycopene依次延伸为C45和C50骨架，crtYg/crtYh编码γ-环化酶，crtX编码糖基转移酶。利用番茄红素生产宿主表达Otnes7来源基因簇后，sarcinaxanthin产量达2.5 mg/g CDW，较野生型提高约150倍，且实现100%底物转化。进一步构建杂合操纵子（M. luteus crtE2与谷氨酸棒杆菌crtYe/crtYf联用）时，生成了sarcinaxanthin（35%）、新化合物sarprenoxanthin（46%）和decaprenoxanthin（19%）三种产物，证明CrtYe/CrtYf具备ε-与γ-双重环化活性。该工作首次完整报道了γ-环状C50类胡萝卜素的生物合成路径，并揭示了C50环化酶的多功能性，为利用合成生物学工具创制结构多样的类胡萝卜素提供了新策略。
创新点
首次报道γ-环状C50类胡萝卜素的完整生物合成途径；鉴定了M. luteus特异性γ-环化酶CrtYg/CrtYh；发现C. glutamicum的CrtYe/CrtYf环化酶兼具ε-和γ-双重环化活性，可同时产生三种不同环状C50类胡萝卜素；鉴定并命名了新的不对称C50类胡萝卜素sarprenoxanthin；利用海洋分离株Otnes7的基因实现了2.5 mg/g CDW的sarcinaxanthin高产。
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli XL1-Blue | C50类胡萝卜素生物合成 | crtE | CrtE（GGPP合酶） | 催化 | 基因来源为Micrococcus luteus；催化FPP生成GGPP，是类胡萝卜素前体合成步骤。 |
| Escherichia coli XL1-Blue | C50类胡萝卜素生物合成 | crtB | CrtB（八氢番茄红素合酶） | 催化 | 基因来源为Micrococcus luteus；催化GGPP转化为八氢番茄红素。 |
| Escherichia coli XL1-Blue | C50类胡萝卜素生物合成 | crtI | CrtI（八氢番茄红素脱氢酶） | 催化 | 基因来源为Micrococcus luteus；催化八氢番茄红素脱氢生成番茄红素。 |
| Escherichia coli XL1-Blue | C50类胡萝卜素生物合成 | crtE2 | CrtE2（番茄红素延长酶） | 催化 | 基因来源为Micrococcus luteus NCTC2665或Otnes7；催化lycopene→nonaflavuxanthin→flavuxanthin的连续延长反应；Otnes7版本转化率79%，NCTC2665版本为23%。 |
| Escherichia coli XL1-Blue | C50类胡萝卜素生物合成 | crtYg, crtYh | CrtYg/CrtYh（C50 γ-环化酶两亚基） | 催化 | 基因来源为Micrococcus luteus；两亚基共同构成γ-环化酶，催化flavuxanthin环化为sarcinaxanthin；不能以lycopene为底物。 |
| Escherichia coli XL1-Blue | C50类胡萝卜素生物合成 | crtX | CrtX（糖基转移酶） | 催化 | 基因来源为Micrococcus luteus；催化sarcinaxanthin糖基化生成单/双葡萄糖苷，约10%产物被糖基化。 |
| Escherichia coli XL1-Blue | C50类胡萝卜素生物合成 | crtYe, crtYf | CrtYe/CrtYf（C50 ε/γ-双功能环化酶） | 催化 | 基因来源为Corynebacterium glutamicum；异源表达时同时产生decaprenoxanthin（ε-环）、sarcinaxanthin（γ-环）和新的不对称sarprenoxanthin（ε+γ环），比例约为19%:35%:46%。 |
| Escherichia coli XL1-Blue | C50类胡萝卜素生物合成 | crtEb | CrtEb（番茄红素延长酶） | 催化 | 基因来源为Corynebacterium glutamicum；在对照实验中作为与M. luteus crtE2功能相似的番茄红素延长酶。 |
关键发现
- 克隆了M. luteus NCTC2665的sarcinaxanthin生物合成基因簇（crtE, crtB, crtI, crtE2, crtYg, crtYh, crtX）。野生型NCTC2665总类胡萝卜素为145 μg/g CDW，海洋分离株Otnes7为190 μg/g CDW。完整基因簇在E. coli中仅产10-15 μg/g CDW的sarcinaxanthin
- 采用番茄红素生产宿主E. coli(pAC-LYC)并表达crtE2YgYh后，NCTC2665来源基因产2.3 mg/g CDW，Otnes7来源基因产2.5 mg/g CDW（约150倍提高），且Otnes7菌株基因实现100%番茄红素转化。crtE2编码番茄红素延长酶，将lycopene依次转化为C45 nonaflavuxanthin和C50 flavuxanthin，Otnes7版本底物转化率79%，NCTC2665版本为23%。crtYg/crtYh编码γ-环化酶，不能以lycopene为底物。crtX编码糖基转移酶，约10%的sarcinaxanthin被糖基化。表达杂合操纵子（M. luteus crtE2 + C. glutamicum crtYeYf）产生三种C50类胡萝卜素：35% sarcinaxanthin、46% sarprenoxanthin（新化合物）、19% decaprenoxanthin，证明CrtYe/CrtYf具有ε-和γ-双功能环化活性。
研究结论
本研究阐明了M. luteus中sarcinaxanthin从FPP经过lycopene、nonaflavuxanthin、flavuxanthin到sarcinaxanthin的完整生物合成途径及糖基化机制。CrtYg/CrtYh构成γ-环化酶，而C. glutamicum的CrtYe/CrtYf具有多功能环化活性，能生成结构多样的C50类胡萝卜素。Otnes7来源的基因在大肠杆菌中可实现高效异源生产，显示出C50环化酶作为合成生物学工具用于创制新型类胡萝卜素的潜力。