Elucidation of a Carotenoid Biosynthesis Gene Cluster Encoding a Novel Enzyme, 2,2'-β-Hydroxylase, from Brevundimonas sp. Strain SD212 and Combinatorial Biosynthesis of New or Rare Xanthophylls
- 作者
- Yasuhiro Nishida, Kyoko Adachi, Hiroaki Kasai, Yoshikazu Shizuri, Kazutoshi Shindo, Akiyoshi Sawabe, Sadao Komemushi, Wataru Miki, Norihiko Misawa
- 单位
- School of Agriculture, Kinki University; Marine Biotechnology Institute; Japan Women's University; Suntory Limited
- 杂志
- Applied and Environmental Microbiology（2005）
- DOI
- 10.1128/AEM.71.8.4286-4296.2005
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
从海洋细菌Brevundimonas sp. strain SD212中分离并鉴定类胡萝卜素生物合成基因簇，特别是发现编码2,2'-β-羟化酶的新基因crtG，并利用组合生物合成产生结构新颖或稀有的叶黄素类化合物。
研究策略
利用crtI保守序列作为探针从Brevundimonas sp. SD212中分离出12 kb的类胡萝卜素基因簇；通过在大肠杆菌中的互补实验对各个基因进行功能分析；将新鉴定的crtG基因与不同的类胡萝卜素生物合成基因组合，在大肠杆菌中实现新/稀有叶黄素的组合生物合成，并评估其抗氧化活性。
核心内容
该研究从海洋细菌Brevundimonas sp. SD212中克隆了一个长约12 kb的类胡萝卜素生物合成基因簇，包含12个开放阅读框，其中鉴定了7个已知基因和一个新基因crtG。通过在大肠杆菌中的异源互补实验，证实crtG编码一种新的类胡萝卜素2,2'-β-羟化酶，该酶与动物甾醇-C5-脱饱和酶具有部分序列同源性。将crtG与不同类胡萝卜素合成基因组合共表达，成功实现了组合生物合成：使积累玉米黄质的菌株产生nostoxanthin和caloxanthin等稀有叶黄素，使积累角黄素的菌株产生新化合物2,2'-二羟基角黄素及其单羟基衍生物。抗氧化活性测定显示，2,2'-二羟基角黄素的IC50为4.8 μM，2-羟基角黄素为8.1 μM，均显著强于角黄素（50 μM）和β-胡萝卜素（>100 μM）。该研究首次揭示了Brevundimonas属类胡萝卜素基因簇的完整构成，发现了催化2,2'位羟化的新酶，并通过组合生物合成策略获得了抗氧化活性大幅提升的新型叶黄素，为类胡萝卜素类药物的开发提供了新途径。
创新点
首次从Brevundimonas属中克隆并阐明类胡萝卜素生物合成基因簇；发现新基因crtG编码类胡萝卜素2,2'-β-羟化酶，该酶与动物甾醇-C5-脱饱和酶有部分同源性；通过组合生物合成获得了新的化合物2,2'-二羟基角黄素以及稀有叶黄素如nostoxanthin和caloxanthin；发现2-羟基化类胡萝卜素具有显著增强的抗氧化活性。
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | 类胡萝卜素生物合成 | crtG | CrtG (类胡萝卜素2,2'-β-羟化酶) | 催化 | 基因来自Brevundimonas sp. SD212，催化β-环2,2'位羟基化，需要3-羟基或4-酮基-β端基作为底物 |
| Escherichia coli | 类胡萝卜素生物合成 | crtW | CrtW (β-胡萝卜素4,4'-加氧酶/酮化酶) | 催化 | 基因来自Brevundimonas sp. SD212，催化β-胡萝卜素4,4'位酮基化 |
| Escherichia coli | 类胡萝卜素生物合成 | crtY | CrtY (番茄红素环化酶) | 催化 | 基因来自Brevundimonas sp. SD212，催化番茄红素环化生成β-胡萝卜素 |
| Escherichia coli | 类胡萝卜素生物合成 | crtI | CrtI (八氢番茄红素脱饱和酶) | 催化 | 基因来自Brevundimonas sp. SD212，催化八氢番茄红素脱饱和生成番茄红素 |
| Escherichia coli | 类胡萝卜素生物合成 | crtB | CrtB (八氢番茄红素合酶) | 催化 | 基因来自Brevundimonas sp. SD212，催化两分子GGPP缩合生成八氢番茄红素 |
| Escherichia coli | 类胡萝卜素生物合成 | crtE | CrtE (GGPP合酶) | 催化 | 基因来自Brevundimonas sp. SD212，催化FPP延伸生成GGPP |
| Escherichia coli | 类胡萝卜素生物合成 | idi | Idi (异戊烯基焦磷酸异构酶，type 2) | 催化 | 基因来自Brevundimonas sp. SD212，催化IPP异构化为DMAPP |
| Escherichia coli | 类胡萝卜素生物合成 | crtZ | CrtZ (β-胡萝卜素3,3'-羟化酶) | 催化 | 基因来自Brevundimonas sp. SD212，催化β-环3,3'位羟基化 |
关键发现
- 基因簇长度为11,991 bp，包含12个ORFs，其中7个已知基因(crtW, crtY, crtI, crtB, crtE, idi, crtZ)和1个新基因crtG（ORF11）。CrtG由257个氨基酸组成，与动物甾醇-C5-脱饱和酶在51-233位有28%的氨基酸同一性。在大肠杆菌中，crtG使积累玉米黄质的菌株产生(2R,2'R)-二羟基玉米黄质（nostoxanthin）和(2R)-羟基玉米黄质（caloxanthin）
- 使积累角黄素的菌株产生新化合物2,2'-二羟基角黄素和2-羟基角黄素。抗氧化活性测定显示：β-胡萝卜素IC50 >100 μM，角黄素IC50=50 μM，2-羟基角黄素IC50=8.1 μM，2,2'-二羟基角黄素IC50=4.8 μM。纯化产量：从2 L培养物获得0.05-0.1 mg产物，从10 L培养物获得0.2-0.8 mg产物。
研究结论
本研究阐明了一种新型类胡萝卜素生物合成基因簇，发现了新酶CrtG（2,2'-β-羟化酶），并通过组合生物合成成功生产了多种新或稀有的叶黄素。其中2,2'-二羟基角黄素显示出比角黄素强约10倍的抗氧化活性，表明该方法在药物开发和营养补充剂领域具有应用潜力。