Identification of a Hotdog Fold Thioesterase Involved in the Biosynthesis of Menaquinone in Escherichia coli
- 作者
- Minjiao Chen, Xinyu Ma, Xiaolei Chen, Ming Jiang, Haigang Song, Zhihong Guo
- 单位
- Department of Chemistry and State Key Laboratory of Molecular Neuroscience, The Hong Kong University of Science and Technology, Clear Water Bay, Kowloon, Hong Kong SAR, China
- 杂志
- Journal of Bacteriology（2013）
- DOI
- 10.1128/JB.00141-13
- 所属领域
- 微生物学
- 关键词
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解决的核心问题
在大肠杆菌甲萘醌生物合成中，尚未确定从1,4-二羟基-2-萘甲酰辅酶A（DHNA-CoA）水解为1,4-二羟基-2-萘甲酸（DHNA）的酶，尽管YbgC与已知的Slr0204同源，但缺乏该水解活性。
研究策略
对大肠杆菌中所有九种热狗折叠硫酯酶进行基于活性的筛选，体外酶动力学表征，并通过基因敲除突变株分析醌类含量以验证YdiI的生理功能。
研究路线图
核心内容
该研究针对大肠杆菌甲萘醌生物合成途径中一个长期未解的问题：1,4-二羟基-2-萘甲酰辅酶A（DHNA-CoA）水解为1,4-二羟基-2-萘甲酸（DHNA）所需的硫酯酶一直未被鉴定。作者对大肠杆菌全部九种热狗折叠硫酯酶进行了基于活性的筛选和体外酶动力学表征，并通过基因敲除突变株分析醌类含量验证生理功能。结果发现，原先基于同源性的候选基因YbgC对DHNA-CoA并无水解活性（催化效率<6.0 M⁻¹·s⁻¹），而YdiI表现出最高活性，其Km为2.5±0.3 μM，kcat为6.2±0.2 s⁻¹，催化效率达2.5×10⁶ M⁻¹·s⁻¹；EntH（YbdB）活性中等。ΔydiI突变体在厌氧条件下MK-8产量较亲本菌株下降67%，与ΔmenH突变体表型相似，而ΔybgC和ΔentH突变体对MK-8产量影响不大。该研究首次将YdiI鉴定为大肠杆菌甲萘醌生物合成中的DHNA-CoA硫酯酶并命名为MenI，同时揭示序列同源性不能可靠预测热狗折叠硫酯酶的功能，完善了经典的甲萘醌生物合成途径。
创新点
首次鉴定YdiI为大肠杆菌甲萘醌生物合成中的DHNA-CoA硫酯酶，并命名为MenI；发现序列同源性不能可靠预测热狗折叠硫酯酶的功能。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | 甲萘醌生物合成 | ydiI | YdiI (MenI) | 催化 | 鉴定为DHNA-CoA硫酯酶，水解DHNA-CoA为DHNA，是甲萘醌生物合成所必需。 |
| Escherichia coli | 甲萘醌生物合成 | ybgC | YbgC | 催化 | 与Slr0204同源，但对DHNA-CoA无水解活性，不参与甲萘醌生物合成。 |
| Escherichia coli | 铁载体enterobactin生物合成 | entH (ybdB) | EntH (YbdB) | 催化 | 具有较低的DHNA-CoA水解活性，但生理功能是enterobactin生物合成中的II型硫酯酶。 |
| Escherichia coli | 甲萘醌生物合成 | menB | MenB | 催化 | 编码DHNA-CoA合成酶，而非硫酯酶，排除其水解功能。 |
| Escherichia coli | 甲萘醌生物合成 | menH | MenH | 催化 | SHCHC合酶，敲除突变体导致甲萘醌产量降低，作为阳性对照。 |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | 叶绿醌生物合成 | slr0204 | Slr0204 | 催化 | 已知的DHNA-CoA硫酯酶，用于与YdiI比较。 |
关键发现
- YbgC对DHNA-CoA无水解活性，催化效率<6.0 M^-1·s^-1
- YdiI对DHNA-CoA具有最高活性，Km=2.5±0.3 μM，kcat=6.2±0.2 s^-1，kcat/Km=2.5×10^6 M^-1·s^-1
- EntH（YbdB）对DHNA-CoA活性中等，Km=0.33 μM，kcat=0.13 s^-1，kcat/Km=4.0×10^5 M^-1·s^-1
- ΔydiI突变体在厌氧条件下MK-8产量比亲本菌株减少67%，与ΔmenH突变体相似
- ΔybgC和ΔentH突变体对MK-8产量影响不大
- YdiI与Slr0204序列一致性仅6%，与EntH一致性59%。
研究结论
YdiI是大肠杆菌甲萘醌生物合成中催化DHNA-CoA水解的硫酯酶，命名为MenI，从而完善了经典的甲萘醌生物合成途径。