Carotenoid biosynthetic pathways are regulated by a network of multiple cascades of alternative sigma factors in Azospirillum brasilense Sp7
- 作者
- Ashutosh Kumar Rai, Ashutosh Prakash Dubey, Santosh Kumar, Debashis Dutta, Mukti Nath Mishra, Bhupendra Narain Singh, Anil Kumar Tripathi
- 单位
- School of Biotechnology, Faculty of Science, Banaras Hindu University, Varanasi- 221005, India; Division of Microbiology, Central Drug Research Institute, Lucknow- 226015, India
- 杂志
- Journal of Bacteriology（2017）
- DOI
- 10.1128/JB.00460-16
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解析巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense Sp7)中类胡萝卜素生物合成途径受多级替代sigma因子级联调控的分子机制，特别是RpoE和RpoH如何协同调控crtE基因。
研究策略
通过基因敲除、启动子-lacZ融合、双质粒异源表达系统、5'RACE转录起始位点鉴定、定点突变和实时定量PCR等方法，系统解析RpoE/RpoH级联对crtE1/crtE2的调控关系。
研究路线图
核心内容
该研究以巴西固氮螺菌Sp7为对象，通过基因敲除、启动子-lacZ融合、双质粒异源表达、5'RACE及定点突变等策略，解析了类胡萝卜素生物合成受多级替代sigma因子级联调控的机制。结果发现crtE1失活使类胡萝卜素含量减少约75%，而crtE2失活仅减少不足25%，表明crtE1是主要贡献基因。启动子活性分析显示，RpoE1和RpoE2不能直接激活crtE1或crtE2启动子，但RpoH1和RpoH2可直接激活crtE2启动子；进一步证实RpoE1直接激活rpoH2和rpoH5（活性上调超3倍），RpoE2直接激活rpoH1和rpoH4（约3倍），且过表达rpoH1和rpoH2均能显著提升类胡萝卜素产量，其中RpoH2作用最强。该工作首次在类胡萝卜素产生菌中阐明RpoE1→RpoH2→CrtE2与RpoE2→RpoH1→CrtE2两条级联通路，并提示crtE1可能经由未知中间因子受RpoE间接调控，揭示了细菌类胡萝卜素合成受sigma因子网络精细调控的新模式，为异源强化类胡萝卜素生产提供了潜在调控靶点。
创新点
首次在类胡萝卜素产生菌中证明类胡萝卜素生物合成受多级sigma因子级联网络调控，具体揭示RpoE1→RpoH2→CrtE2和RpoE2→RpoH1→CrtE2两条级联通路。
研究对象（11）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Azospirillum brasilense Sp7 | 类胡萝卜素生物合成 | crtE1 | GGPP合酶（CrtE1） | 催化 | 催化法尼基焦磷酸转化为香叶基香叶基焦磷酸，类胡萝卜素合成第一步关键酶 |
| Azospirillum brasilense Sp7 | 类胡萝卜素生物合成 | crtE2 | GGPP合酶（CrtE2） | 催化 | GGPP合酶第二个旁系同源物，受RpoH1和RpoH2直接调控 |
| Azospirillum brasilense Sp7 | 类胡萝卜素生物合成调控 | rpoE1 | RpoE1（ECF sigma因子） | 调控 | 直接激活rpoH2和rpoH5启动子，间接调控crtE2 |
| Azospirillum brasilense Sp7 | 类胡萝卜素生物合成调控 | rpoE2 | RpoE2（ECF sigma因子） | 调控 | 直接激活rpoH1和rpoH4启动子，间接调控crtE2 |
| Azospirillum brasilense Sp7 | 类胡萝卜素生物合成调控 | rpoH1 | RpoH1（热激sigma因子） | 调控 | 受RpoE2直接调控，直接激活crtE2启动子 |
| Azospirillum brasilense Sp7 | 类胡萝卜素生物合成调控 | rpoH2 | RpoH2（热激sigma因子） | 调控 | 受RpoE1直接调控，直接激活crtE2启动子；过表达最强促进类胡萝卜素合成 |
| Azospirillum brasilense Sp7 | 类胡萝卜素生物合成调控 | rpoH3 | RpoH3（热激sigma因子） | 调控 | 不受RpoE1/RpoE2调控，过表达不影响类胡萝卜素含量 |
| Azospirillum brasilense Sp7 | 类胡萝卜素生物合成调控 | rpoH4 | RpoH4（热激sigma因子） | 调控 | 受RpoE2直接调控，但不直接调控crtE2，可能参与其他应激响应 |
| Azospirillum brasilense Sp7 | 类胡萝卜素生物合成调控 | rpoH5 | RpoH5（热激sigma因子） | 调控 | 受RpoE1直接调控，但不直接调控crtE2，可能参与其他应激响应 |
| Azospirillum brasilense Sp7 | 类胡萝卜素生物合成调控 | chrR1 | ChrR1（锌结合抗sigma因子） | 调控 | RpoE1的认知抗sigma因子，失活导致RpoE1过表达（Car-1突变体） |
| Escherichia coli DH5α | 异源双质粒系统 | — | — | 调控 | 作为异源宿主，用于验证A. brasilense sigma因子对目标启动子的直接激活 |
关键发现
- crtE1失活导致类胡萝卜素含量减少约75%，crtE2失活减少<25% (P<0.03)
- 在Car-1突变体中crtE1和crtE2启动子活性均显著升高，其中crtE1启动子活性更高
- 双质粒系统中RpoE1/RpoE2不能直接激活crtE1/crtE2启动子，而RpoH1和RpoH2能直接激活crtE2启动子
- RpoE1直接激活rpoH2和rpoH5启动子（活性上调>3倍），RpoE2直接激活rpoH1和rpoH4启动子（活性上调约3倍）
- rpoH2转录在Car-1中上调>5倍，在rpoE1::km中下调约0.5倍
- 过表达rpoH1和rpoH2显著增加类胡萝卜素含量，且RpoH2作用最强。
研究结论
在A. brasilense Sp7中，类胡萝卜素生物合成受RpoE和RpoH组成的多级sigma因子级联网络调控：RpoE1通过RpoH2、RpoE2通过RpoH1间接激活crtE2；crtE1则通过未知中间调控因子被RpoE间接调控。该研究首次揭示细菌类胡萝卜素合成受多级sigma因子级联调控。