SigF Controls Carotenoid Pigment Production and Affects Transformation Efficiency and Hydrogen Peroxide Sensitivity in Mycobacterium smegmatis
- 作者
- Roberta Provvedi, Dana Kocincová, Valentina Donà, Daniel Euphrasie, Mamadou Daffé, Gilles Etienne, Riccardo Manganelli, Jean-Marc Reyrat
- 单位
- Dipartimento di Biologia, Università di Padova; Université Paris Descartes, Faculté de Médecine Paris Descartes; INSERM, U570; Dipartimento di Istologia, Microbiologia e Biotecnologie Mediche, Università di Padova; Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale, Unité Mixte de Recherche du Centre National de la Recherche Scientifique et de l'Université Paul Sabatier (UMR5089), Departement Mécanismes Moléculaires des Infections Mycobactériennes
- 杂志
- Journal of Bacteriology（2008）
- DOI
- 10.1128/JB.00714-08
- 所属领域
- 微生物学
- 关键词
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解决的核心问题
阐明非致病性分枝杆菌耻垢分枝杆菌中替代sigma因子σ^F对类胡萝卜素色素产生、电转化效率和过氧化氢敏感性的调控作用。
研究策略
通过Tn611转座子插入突变库筛选色素缺失突变体，采用基因互补、薄层色谱分析、定量RT-PCR、5'RACE转录起始位点作图及全基因组SigF结合位点搜索等方法揭示σ^F的调控网络。
研究路线图
核心内容
本研究通过Tn611转座子插入突变筛选，在耻垢分枝杆菌中鉴定了替代sigma因子σ^F对类胡萝卜素合成及表型性状的调控功能。转座子插入sigF使菌落由黄橙色变为白色，薄层色谱显示野生型含四种黄色素而突变体缺失，基因互补可恢复色素产生。定量RT-PCR表明crtI转录在sigF突变体中降低约29倍，互补株恢复80%表达；5'RACE定位到crtI上游-104 bp处存在与结核分枝杆菌SigF一致序列的启动子。功能分析显示，sigF突变体电转化效率达(9.5±1.2)×10^4转化子/μg DNA，较野生型（≤10）提高约10^4倍，而互补菌株降至(1.3±0.1)×10^2；此外突变体对过氧化氢敏感性明显增强。全基因组搜索发现多个基因上游存在SigF结合位点。这些结果表明σ^F直接正调控类胡萝卜素合成基因簇转录，并通过影响细胞壁相关组分调节转化效率与氧化应激抵抗，且其调节子在不同分枝杆菌间已发生显著分化，为深入理解分枝杆菌sigma因子网络提供了新视角。
创新点
['首次证明σ^F直接控制耻垢分枝杆菌类胡萝卜素合成基因簇的表达', '发现sigF突变可提高电转化效率约10^4倍', '鉴定出多个推定SigF靶基因并证明σ^F调节子在不同分枝杆菌间高度分化']
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Mycobacterium smegmatis ATCC 607 | 类胡萝卜素生物合成 | sigF | σ^F | 调控 | 替代sigma因子，突变导致色素缺失、转化效率提高和过氧化氢敏感 |
| Mycobacterium smegmatis ATCC 607 | 类胡萝卜素生物合成 | rsbW | RsbW | 调控 | 编码σ^F的潜在抗sigma因子，与sigF共转录 |
| Mycobacterium smegmatis ATCC 607 | 类胡萝卜素生物合成 | crtE | CrtE | 催化 | GGPP合酶，催化法尼基焦磷酸生成香叶基香叶基焦磷酸，基因位于远离基因簇1.8 Mb处 |
| Mycobacterium smegmatis ATCC 607 | 类胡萝卜素生物合成 | crtB | CrtB | 催化 | 八氢番茄红素合酶，催化GGPP转化为八氢番茄红素 |
| Mycobacterium smegmatis ATCC 607 | 类胡萝卜素生物合成 | crtI | CrtI | 催化 | 八氢番茄红素脱饱和酶，催化八氢番茄红素生成番茄红素，其表达受σ^F直接调控 |
| Mycobacterium smegmatis ATCC 607 | 类胡萝卜素生物合成 | crtYc/crtYd | CrtYc/CrtYd | 催化 | 番茄红素环化酶的两个亚基，催化番茄红素生成β-胡萝卜素 |
| Mycobacterium smegmatis ATCC 607 | 类胡萝卜素生物合成 | crtU | CrtU | 催化 | 催化β-胡萝卜素脱饱和生成异renierat烷 |
关键发现
- 转座子插入sigF导致菌落由黄橙色变为白色
- TLC显示野生型有4种黄色素，突变体缺失，互补恢复。crtI mRNA在sigF突变体中降低约29倍，互补株恢复80%表达。在crtI上游-104 bp处存在与结核分枝杆菌SigF一致序列的启动子，转录起始点位于-10区下游9 bp。sigF突变体转化效率为(9.5±1.2)×10^4 transformants/μg DNA，野生型≤10，互补菌株为(1.3±0.1)×10^2，比突变体降低100倍以上。突变体对过氧化氢的敏感性显著增加。基因组搜索发现多个基因上游存在SigF一致序列。
研究结论
在耻垢分枝杆菌中，σ^F正调控类胡萝卜素合成基因簇的转录，并且可能通过调控细胞壁相关组分影响转化效率和过氧化氢抵抗力；SigF调节子在不同分枝杆菌种间已发生显著分化。