Isoreineratene Biosynthesis in Green Sulfur Bacteria Requires the Cooperative Actions of Two Carotenoid Cyclases
- 作者
- Julia A. Maresca, Steven P. Romberger, Donald A. Bryant
- 单位
- Department of Biochemistry and Molecular Biology, The Pennsylvania State University, University Park, Pennsylvania 16802
- 杂志
- Journal of Bacteriology（2008）
- DOI
- 10.1128/JB.00758-08
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
阐明绿色硫细菌中异海绵烯生物合成所需的类胡萝卜素环化酶及其协同作用，确定单环与双环类胡萝卜素合成的分支点。
研究策略
通过基因组分析鉴定cruA同源物，在大肠杆菌中异源表达cruA和cruB，以及在Chlorobaculum tepidum中异源表达cruB，结合HPLC和质谱分析类胡萝卜素产物。
研究路线图
核心内容
该研究通过基因组分析在大肠杆菌中异源表达绿色硫细菌的cruA和cruB基因，结合HPLC和质谱鉴定产物，首次阐明了异海绵烯生物合成所需两种类胡萝卜素环化酶的协同作用。所有已测序绿色硫细菌基因组均含一个cruA直系同源物，与CruB平均一致性为56%。在大肠杆菌中单独表达CruA_Cp可将番茄红素全部转化为γ-胡萝卜素但几乎无环化活性，单独表达CruB时β-胡萝卜素占总色素不足25%且无γ-胡萝卜素积累，而共表达两者时几乎所有番茄红素转化为β-胡萝卜素。在Chlorobaculum tepidum中表达cruB_Cc后主要产物为β-异海绵烯和β-胡萝卜素，仅痕量氯菌烯。结果表明CruA是番茄红素单环化酶，CruB是γ-胡萝卜素环化酶，催化γ-胡萝卜素生成β-胡萝卜素是异海绵烯生物合成的关键第一步，绿色硫细菌中单环与双环类胡萝卜素的分支点位于γ-胡萝卜素修饰阶段，与蓝细菌不同。
创新点
首次鉴定CruB为γ-胡萝卜素环化酶，证明GSB中单环与双环类胡萝卜素的分支点在于γ-胡萝卜素的修饰而非番茄红素环化；首次在绿色硫细菌中实现异源基因的功能表达。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | 类胡萝卜素生物合成 | cruA (cruA_Ct / cruA_Cp) | CruA | 催化 | 番茄红素单环化酶，催化番茄红素生成γ-胡萝卜素 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 类胡萝卜素生物合成 | cruB (cruB_Cp) | CruB | 催化 | γ-胡萝卜素环化酶，催化γ-胡萝卜素生成β-胡萝卜素 |
| Chlorobaculum tepidum | 类胡萝卜素生物合成 | cruB (cruB_Cc) | CruB | 催化 | 异源表达于bchU位点，使菌株产生β-异海绵烯和β-胡萝卜素 |
| C. phaeobacteroides DSM 266T | 类胡萝卜素生物合成 | cruA, cruB | CruA, CruB | 催化 | 异海绵烯产生菌中的两个环化酶，共同合成双环类胡萝卜素 |
| Chlorobaculum tepidum | 细菌叶绿素c生物合成 | bchU | BchU | 催化 | C-20甲基转移酶，作为异源表达插入位点 |
| 绿色硫细菌 | 类胡萝卜素生物合成 | crtU | CrtU | 催化 | 环脱饱和酶/甲基转移酶，催化芳香环形成 |
关键发现
- 所有已测序GSB基因组均含一个cruA直系同源物，平均65%一致性、79%相似性
- CruB与CruA_Ct平均56%一致性、74%相似性。在大肠杆菌中，CruA_Cp将全部番茄红素转化为γ-胡萝卜素（几乎无双环化活性）
- 单独表达CruB_Cp时β-胡萝卜素占总色素少于25%且无γ-胡萝卜素积累
- 共表达CruA与CruB时几乎所有番茄红素转化为β-胡萝卜素。对于神经孢烯，CruA_Cp仅产生单环的7,8-二氢-γ-胡萝卜素，而CruA_Ct产生双环的7,8-二氢-β-胡萝卜素
- CruB_Cp单独作用也主要产生7,8-二氢-β-胡萝卜素
- 产物分子量为538 Da。在C. tepidum中表达cruB_Cc后，主要类胡萝卜素为β-异海绵烯和β-胡萝卜素，仅痕量氯菌烯。
研究结论
CruA是GSB中的番茄红素单环化酶，CruB是异海绵烯产生菌中的γ-胡萝卜素环化酶，催化γ-胡萝卜素生成β-胡萝卜素，这是异海绵烯生物合成的第一个关键步骤。与蓝细菌不同，GSB中单环与双环类胡萝卜素的分支点在γ-胡萝卜素修饰阶段。