Identification of Sesquiterpene Synthases from Nostoc punctiforme PCC 73102 and Nostoc sp. Strain PCC 7120
- 作者
- Sean A. Agger, Fernando Lopez-Gallego, Thomas R. Hoye, Claudia Schmidt-Dannert
- 单位
- Department of Biochemistry, Molecular Biology and Biophysics, University of Minnesota; Department of Chemistry, University of Minnesota
- 杂志
- Journal of Bacteriology（2008）
- DOI
- 10.1128/JB.00759-08
- 所属领域
- 天然产物生物合成与酶学
- 关键词
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解决的核心问题
从蓝藻中鉴定并表征倍半萜合酶，探索蓝藻萜类生物合成途径及P450功能
研究策略
基于序列同源搜索预测蓝藻倍半萜合酶基因，通过异源表达、产物分离与结构鉴定（GC-MS/NMR）、酶动力学分析和P450共表达研究其功能
研究路线图
核心内容
本研究从两种蓝藻Nostoc punctiforme PCC 73102和Nostoc sp. PCC 7120中鉴定并表征了三个倍半萜合酶。通过序列同源搜索预测候选基因，随后在大肠杆菌中异源表达，并利用GC-MS和NMR对产物进行结构鉴定。结果显示，NS1催化法尼基焦磷酸生成germacrene A（高温下98%重排为β-elemene），NP1生成罕见的8a-epi-alpha-selinene（此前仅在白蚁中发现），NP2则生成germacradienol（50%）、germacrene D（40%）和β-elemene（10%）的混合物。酶动力学分析表明NS1的Km为3.4 μM，kcat为4.4×10⁻² s⁻¹，NP1的Km为2.5 μM，kcat为6.3×10⁻² s⁻¹。发酵罐中NP1产物产量约为1 mg/run。研究还首次实现了蓝藻P450在大肠杆菌中的功能性表达，与NS1共表达后产生了三个分子量为220的含氧倍半萜（germacrene A羟基化产物）。这些结果证实蓝藻具有催化倍半萜环化的合酶，其基因常与P450等形成基因簇，罕见产物8a-epi-alpha-selinene可能具有生态防御功能，为蓝藻萜类生物合成途径的深入解析奠定了基础。
创新点
首次表征蓝藻来源的倍半萜合酶；发现NP1产物为罕见的8a-epi-alpha-selinene（此前仅在白蚁中发现）；首次实现蓝藻P450在大肠杆菌中的功能性表达
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli JM109 | 倍半萜生物合成 | NS1 | 倍半萜合酶NS1 | 催化 | 来自Nostoc sp. PCC 7120，催化FPP环化生成germacrene A |
| Escherichia coli JM109 | 倍半萜生物合成 | NP1 | 倍半萜合酶NP1 | 催化 | 来自Nostoc punctiforme PCC 73102，催化FPP环化生成8a-epi-alpha-selinene |
| Escherichia coli JM109 | 倍半萜生物合成 | NP2 | 融合型倍半萜合酶NP2 | 催化 | 来自Nostoc punctiforme PCC 73102，产物为germacradienol、germacrene D和β-elemene，与geosmin合成相关 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 倍半萜生物合成 | P450NS | 细胞色素P450单加氧酶 | 催化 | 来自Nostoc sp. PCC 7120，氧化germacrene A生成含氧产物（m/z 220） |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 倍半萜生物合成 | P450NP | 细胞色素P450单加氧酶 | 催化 | 来自Nostoc punctiforme PCC 73102，但表达量低，未检测到氧化产物 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 倍半萜生物合成 | ferredoxin和ferredoxin:NADPH还原酶 | 铁氧还蛋白/铁氧还蛋白还原酶 | 能量供给 | 来自Nostoc sp. PCC 7120，为P450提供还原力 |
| Escherichia coli | 倍半萜生物合成 | hybrid two-component protein gene | 推定的杂合双组分蛋白 | 调控 | 位于NP1/NS1下游基因簇中，推测参与萜类产物相关调控，未功能验证 |
关键发现
- 从Nostoc punctiforme PCC 73102和Nostoc sp. PCC 7120鉴定三个倍半萜合酶：NS1催化FPP生成germacrene A（GC-MS 90%匹配，高温下98%重排为β-elemene）
- NP1生成8a-epi-alpha-selinene（精确质量204.1876 amu）
- NP2生成germacradienol(50%)、germacrene D(40%)和β-elemene(10%)，未检测到geosmin。NS1动力学参数Km=3.4±0.40 μM, kcat=4.4±1.8×10^-2 s^-1, 催化效率1.3×10^4 s^-1 M^-1
- NP1 Km=2.5±0.46 μM, kcat=6.3±3.1×10^-2 s^-1, 催化效率2.4×10^4 s^-1 M^-1。发酵罐中NP1产物产量约1 mg/run。P450NS与NS1共表达产生三个质量220的含氧倍半萜（germacrene A羟基化产物）。
研究结论
蓝藻Nostoc含有催化倍半萜环化的倍半萜合酶，其基因常与P450及双组分蛋白形成基因簇；NP1罕见产物8a-epi-alpha-selinene可能具有生态防御功能；蓝藻P450可在E. coli中功能表达并氧化倍半萜，为后续研究蓝藻萜类生物合成奠定了基础