Both adhE and a separate NADPH-dependent alcohol dehydrogenase (adhA) are necessary for high ethanol production in Thermoanaerobacterium saccharolyticum
- 作者
- Tianyong Zheng, Daniel G. Olson, Sean J. Murphy, Xiongjun Shao, Liang Tian, Lee R. Lynd
- 单位
- Department of Biological Sciences, Dartmouth College, Hanover, NH, USA; Thayer School of Engineering, Dartmouth College, Hanover, NH, USA; BioEnergy Science Center, Oak Ridge, TN, USA
- 杂志
- Journal of Bacteriology（2017）
- DOI
- 10.1128/JB.00542-16
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解析嗜热厌氧菌Thermoanaerobacterium saccharolyticum中实现高乙醇产量所必需的醇脱氢酶基因，尤其是除adhE外的NADPH依赖型醇脱氢酶adhA在乙醇生产中的功能与重要性。
研究策略
结合单基因/多基因敲除、发酵产物分析、酶活测定、蛋白质异源表达与纯化、回补实验，以及序列比对分析，系统鉴定并验证adhA与adhE在乙醇生产中的必要性与生化特性。
研究路线图
核心内容
该研究以嗜热厌氧菌Thermoanaerobacterium saccharolyticum为对象，系统解析了高乙醇产量所需的醇脱氢酶体系。通过单基因和多基因敲除、发酵产物分析、酶活测定及异源表达纯化等手段，发现除已知的adhE外，一个NADPH依赖的铁离子型醇脱氢酶adhA（Tsac_2087）对高乙醇生产必不可少。在高乙醇菌株LL1049中单敲除adhA使乙醇产量下降约50%；纯化的AdhA蛋白表现出显著的NADPH偏好性（6.8 U/mg），且对氧气不敏感，这与AdhE不同。敲除adhA使NADPH连接的乙醛还原活性降低93%，而敲除adhE则使NADH活性降低98%，表明两者分别承担不同的辅因子还原功能。仅保留adhE和adhA并删除其他四个注释醇脱氢酶基因的菌株仍能达到0.45 g/g的乙醇产量，与亲本相当；双敲除两者则几乎完全丧失相关酶活。回补实验进一步证实了二者的功能互补性。该工作首次在天然宿主中证明了AdhA对高乙醇产量的必要性，揭示了adhE与adhA共同构成完整的醇脱氢酶体系，为在其他产乙醇微生物中通过引入这两个基因提升乙醇产量提供了理论依据。
创新点
首次在天然含adhA的宿主中证明铁离子依赖性AdhA（Tsac_2087）对高乙醇产量至关重要；揭示AdhA是NADPH连接的主要未被识别的醇脱氢酶；证明adhE和adhA同时存在是高乙醇产量所必需的；发现AdhA具有氧不敏感性，不同于AdhE。
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Thermoanaerobacterium saccharolyticum JW/SL-YS485 | 乙酰辅酶A到乙醇的代谢通路 | adhA (Tsac_2087) | AdhA（铁离子依赖性醇脱氢酶） | 催化 | NADPH连接的乙醛还原为乙醇，氧不敏感性 |
| Thermoanaerobacterium saccharolyticum JW/SL-YS485 | 乙酰辅酶A到乙醇的代谢通路 | adhE (Tsac_0416) | AdhE（双功能醛/醇脱氢酶） | 催化 | 主要提供NADH连接的ADH活性，同时具有ALDH活性，在高乙醇菌株中含G544D突变 |
| Thermoanaerobacterium saccharolyticum JW/SL-YS485 | 乙酰辅酶A到乙醇的代谢通路 | Tsac_0218 | 锌离子结合醇脱氢酶 | 催化 | 单敲除不影响乙醇产量，非必需基因 |
| Thermoanaerobacterium saccharolyticum JW/SL-YS485 | 乙酰辅酶A到乙醇的代谢通路 | Tsac_2222 | 铁离子醇脱氢酶 | 催化 | 单敲除不影响乙醇产量，非必需基因 |
| Thermoanaerobacterium saccharolyticum JW/SL-YS485 | 乙酰辅酶A到乙醇的代谢通路 | Tsac_0285 | 铁离子醇脱氢酶 | 催化 | 单敲除不影响乙醇产量，非必需基因 |
| Thermoanaerobacterium saccharolyticum JW/SL-YS485 | 乙酰辅酶A到乙醇的代谢通路 | Tsac_1049 | 铁离子醇脱氢酶 | 催化 | 单敲除不影响乙醇产量，非必需基因 |
| Thermoanaerobacterium saccharolyticum JW/SL-YS485 | 乙酰辅酶A到乙醇的代谢通路 | Tsac_0219 | 醛脱氢酶 | 催化 | 单敲除不影响乙醇产量，非必需基因 |
| Escherichia coli | 异源蛋白表达 | adhA | AdhA | 催化 | 用于AdhA蛋白表达、纯化及酶学表征 |
关键发现
- 高乙醇菌株LL1049中单敲除adhA使乙醇产量降低约50%（与LL1049相比）
- 在LL1049背景下同时保留adhE和adhA并删除其他4个注释醇脱氢酶基因的菌株LL1332，其乙醇产量为0.45 g/g，与亲本LL1328的0.41 g/g相当
- 在野生型中敲除adhA使NADPH连接的乙醛还原ADH活性降低93%（LL1286 vs LL1025）
- 敲除adhE使NADH-ADH活性降低98%，但对NADPH-ADH活性影响不大
- 双敲除adhE和adhA（LL1335）使NADH活性几乎为零（0.01 U/mg），NADPH活性降低至0.06 U/mg
- 纯化的AdhA的NADPH-ADH活性为6.8±1.7 U/mg，NADH活性仅0.3±0.6 U/mg
- 厌氧与好氧表达条件下AdhA活性分别为6.9±1.9 U/mg和6.8±1.7 U/mg，表明AdhA对氧不敏感
- 回补adhA至LL1333得到LL1402，乙醇产量为0.19 g/g，是LL1333（0.09 g/g）的两倍，但仅恢复至缺失前菌株LL1332的43%
- 回补adhE至LL1334可部分恢复乙醇产量，最高0.22 g/g（LL1403），为野生型的88%。
研究结论
在T. saccharolyticum中，adhA（Tsac_2087）编码一种NADPH依赖的铁离子醇脱氢酶，与adhE共同构成高乙醇产量所必需的醇脱氢酶体系。AdhA的NADPH-ADH活性在高乙醇菌株中用于平衡NADPH供应，缺失adhA会显著降低乙醇产量。该研究为在其他微生物（如C. thermocellum）中通过引入adhA和adhE提高乙醇产量提供了重要依据。