高级醇 · 代谢工程文献库

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The ArcBA Two-Component System of Escherichia coli Is Regulated by the Redox State of both the Ubiquinone and the Menaquinone Pool

作者
Martijn Bekker, Svetlana Alexeeva, Wouter Laan, Gary Sawers, Joost Teixeira de Mattos, Klaas Hellingwerf
单位
Swammerdam Institute for Life Sciences—Molecular Microbial Physiology, University of Amsterdam, Nieuwe Achtergracht 166, 1018 WV Amsterdam, The Netherlands; Institute of Biology/Microbiology, Martin Luther University, Halle-Wittenberg, 06120 Halle, Germany
杂志
Journal of Bacteriology（2010）
DOI
10.1128/JB.01156-09
所属领域
微生物生理学与代谢调控
关键词
ArcBA two-component systemEscherichia colimenaquinonemicroaerobiosisredox sensingubiquinone
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解决的核心问题

揭示大肠杆菌ArcBA双组分系统感知氧气的分子机制，特别是醌池（泛醌和甲基萘醌）的氧化还原状态对ArcB激酶活性的体内调控作用。

研究策略

构建对ArcA-P特异性响应的lacZ报告系统（cydA启动子P1并突变FNR结合位点），结合分批培养和不同通气水平的恒化培养，测定报告基因表达、醌池组成及氧化还原状态；利用泛醌合成缺陷（ΔubiC）和甲基萘醌合成缺陷（ΔmenB）突变体进行遗传学验证，并添加甲基萘醌前体进行回补实验。

研究路线图

100%
研究问题：ArcBA双组分系统感知氧气的分子机制；醌池氧化还原状态对ArcB活性的体内调控
策略：构建ArcA-P特异性lacZ报告系统（cydA启动子P1+突变FNR位点），结合分批/恒化培养测定报告表达、醌池状态；遗传学验证（ΔubiC, ΔmenB）与回补实验
关键改造1：新型cydA(-176+1)-lacZ报告系统，突变FNR结合位点；实现ArcA-P特异性响应（Kd≈0.25μM）
关键改造2：ΔubiC与ΔmenB突变体；甲基萘醌前体回补实验
结果1：ΔmenB厌氧时ArcB完全失活；添加2μM DHNA可恢复野生型表型
结果2：ArcB活性在0%/85%通气时最高，20%/100%最低（~2.5倍）；与泛醌/泛醇比率不匹配
结果3：SixA及代谢物不参与微好氧调控；体外半抑制浓度：泛醌5μM，甲萘醌50μM
结论：ArcBA是氧化还原感应系统；活性由泛醌与甲基萘醌两醌池共同调节
核心发现：ArcB活性呈非线性模式；甲基萘醌池是主要调控因子；泛醌/泛醇比并非唯一决定因素
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核心内容

该研究通过构建不受FNR干扰的ArcA-P依赖性报告系统（cydA(-176+1)-lacZ），结合分批培养与不同通气水平的恒化培养，系统解析了大肠杆菌ArcBA双组分系统感知氧气的分子机制。研究发现，ArcA-P与cydAB调控区DNA结合的半饱和浓度约为0.25 μM，并以六聚体形式结合，而未磷酸化ArcA则以二聚体形式结合，解离常数约为4.5 μM。遗传学实验表明，缺失泛醌合成基因ubiC不影响厌氧-好氧转变中的ArcB调控，而缺失甲基萘醌合成基因menB导致厌氧生长时ArcB完全失活，添加2 μM甲基萘醌前体1,4-二羟基-2-萘甲酸可完全恢复野生型表型，首次在体内证明甲基萘醌池在ArcB激活中发挥关键作用。恒化培养中ArcB活性呈复杂非线性模式，在0%和85%通气时最高，20%和100%通气时最低，极值相差约2.5倍，且与泛醌/泛醇比率不匹配，说明泛醌氧化还原状态并非ArcB活性的唯一决定因素。体外实验显示泛醌对ArcB的半抑制浓度为5 μM，而甲萘醌为50 μM。该工作表明ArcBA系统应被视为氧化还原感应系统而非简单的氧感应系统，其调控由泛醌和甲基萘醌两个醌池的氧化还原状态共同决定。

创新点

['开发了不受FNR干扰的ArcA-P依赖性报告系统（cydA(-176+1)-lacZ，突变FNR框）', '首次在体内证明甲基萘醌池在ArcB激活中发挥重要作用', '发现ArcB活性在微好氧范围内呈复杂非线性调控模式，与泛醌氧化还原状态无直接相关性', '提出ArcB活性受泛醌和甲基萘醌两个醌池氧化还原状态共同调节的工作模型']

研究对象（8）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Escherichia coli K-12 (BW25113/MC4100) ArcBA双组分信号转导系统 arcB ArcB (sensor kinase) 调控 传感器激酶，通过PAS域半胱氨酸氧化还原感应醌池状态
Escherichia coli K-12 (BW25113/MC4100) ArcBA双组分信号转导系统 arcA ArcA (response regulator) 调控 响应调节子，磷酸化后调控cydAB等靶基因表达
Escherichia coli K-12 (BW25113/MC4100) 泛醌生物合成 ubiC UbiC (chorismate lyase) 催化 泛醌合成途径酶；ΔubiC突变体JA023用于研究泛醌作用
Escherichia coli K-12 (BW25113/MC4100) 甲基萘醌生物合成 menB MenB (naphthoate synthase) 催化 甲基萘醌合成途径酶；ΔmenB突变体JA022导致甲基萘醌缺失，厌氧下ArcB失活
Escherichia coli K-12 (BW25113/MC4100) ArcB去磷酸化 sixA SixA (phospho-histidine phosphatase) 调控 磷酸组氨酸磷酸酶；实验排除了其在微好氧条件下对ArcB的调节作用
Escherichia coli K-12 (BW25113/MC4100) 呼吸链（cydAB操纵子） cydA Cytochrome bd oxidase subunit I 能量供给 其启动子P1用于构建ArcA-P依赖性lacZ报告系统
Escherichia coli K-12 (BW25113/MC4100) 全局转录调控 fnr FNR (fumarate nitrate reduction regulator) 调控 报告构建中突变FNR结合位点以避免交叉调控
Escherichia coli K-12 (BW25113/MC4100) 醌池电子传递 — Ubiquinone-8 (UQ8) / Menaquinone-8 (MK8) 能量供给 膜内电子载体；其氧化还原状态作为ArcB活性调控信号

关键发现

  1. ['ArcA-P与cydAB调控区DNA结合的Kd(0.5)约0.25 μM，而未磷酸化ArcA约4.5 μM
  2. Hill系数显示ArcA-P以六聚体结合（n=6），ArcA以二聚体结合（n=2）', '缺失ubiC（泛醌合成缺陷）不影响厌氧-好氧转变中的ArcB调控
  3. 缺失menB（甲基萘醌合成缺陷）导致厌氧生长时ArcB完全失活，添加2 μM 1,4-二羟基-2-萘甲酸（甲基萘醌前体）可完全恢复野生型表型', '恒化培养中ArcB活性在0%和85%通气时最高，在20%和100%通气时最低，最大值约为最小值的2.5倍', '泛醌/泛醇比率随厌氧程度增加而显著升高，但与ArcB活性模式不匹配
  4. 总泛醌含量在80%通气时达到峰值，随后下降', '甲基萘醌池大小在100%至80%通气时显著增加，此后向厌氧方向仅略有增加', 'SixA磷酸酶及代谢物（丙酮酸、乙酸盐、乳酸）在微好氧条件下不参与ArcB活性调节', '体外实验中，泛醌对ArcB激酶活性的半抑制浓度为5 μM，而甲萘醌（menadione）为50 μM']

研究结论

ArcB体内活性受甲基萘醌池氧化还原状态调节，泛醌/泛醇比率并非ArcB活性的唯一决定因素；ArcBA系统应视为氧化还原感应系统而非简单的氧感应系统，其复杂调控模式由泛醌和甲基萘醌两个醌池共同决定。