Product-Mediated Regulation of Pentalenolactone Biosynthesis in Streptomyces Species by the MarR/SlyA Family Activators PenR and PntR
- 作者
- Dongqing Zhu, Yinping Wang, Manman Zhang, Haruo Ikeda, Zixin Deng, David E. Cane
- 单位
- Department of Chemistry, Brown University, Providence, Rhode Island, USA; The Key Laboratory of Combinatorial Biosynthesis and Drug Discovery (Ministry of Education), Wuhan University, Wuhan, Hubei Province, China; Laboratory of Microbial Engineering, Kitasato Institute for Life Sciences, Kitasato University, Sagamihara, Minami-ku, Kanagawa, Japan
- 杂志
- Journal of Bacteriology（2013）
- DOI
- 10.1128/JB.02079-12
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
链霉菌中倍半萜抗生素 pentalenolactone 生物合成基因簇的转录调控机制尚不清楚，尤其是产物如何反馈调节其自身的生物合成。
研究策略
克隆并异源表达 penR 和 pntR 基因，纯化重组蛋白；利用 EMSA 鉴定 PenR/PntR 的 DNA 结合位点及小分子配体；构建 penR 缺失突变株和互补菌株，结合 GC-MS 检测产物产量；采用 RT-PCR 比较基因转录水平；使用 xylE 报告基因验证启动子活性。
核心内容
本研究以链霉菌中倍半萜抗生素pentalenolactone的生物合成基因簇为对象，揭示了其产物介导的反馈调控机制。通过克隆异源表达penR和pntR基因并纯化重组蛋白，利用EMSA鉴定发现PenR与penR-gapN及penM-penH两个间隔区结合，PntR仅与pntR-gapR间隔区结合，结合位点定位于保守的37-bp DNA片段，表观Kd值分别为31、16和9 nM。构建penR缺失突变株后，pentalenolactone及其中间体产量降至GC-MS检测限以下，互补后恢复至野生型水平。RT-PCR和xylE报告基因实验证实PenR/PntR正调控自身抗性基因gapN和羟化酶基因penH的转录，同时抑制penR自身表达。关键发现是pentalenolactone及其晚期中间体在微摩尔浓度下（S0.5为6–8 μM）即可解离蛋白-DNA复合物，而水杨酸无此作用，证明产物作为配体直接解除转录因子的DNA结合。该研究首次将MarR/SlyA家族激活因子与倍半萜抗生素生物合成调控联系起来，阐明了一种产物浓度驱动的反馈回路，为理解次级代谢产物自我调控提供了新视角。
创新点
['首次将 MarR/SlyA 家族转录调控因子与倍半萜抗生素 pentalenolactone 的生物合成调控联系起来。', '发现 PenR/PntR 作为正调控因子激活生物合成和自身抗性基因转录，同时自身抑制 penR/pntR 的表达。', '阐明了产物介导的反馈调节：pentalenolactone 及其晚期中间体在微摩尔浓度下即可解离 PenR/PntR 与 DNA 的结合。', '鉴定了保守的 37-bp DNA 结合位点，包含两个保守基序和一个部分反向重复。']
研究对象（10）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Streptomyces exfoliatus UC5319 | pentalenolactone 生物合成（pen 基因簇） | penR | PenR | 调控 | MarR/SlyA 家族转录激活因子，正调控 gapN-penMHFGEDBAI 和 penHFGEDBAI 操纵子转录，同时抑制 penR 自身转录；产物 pentalenolactone 及其中间体为配体。 |
| Streptomyces arenae TU469 | pentalenolactone 生物合成（pnt 基因簇） | pntR | PntR | 调控 | PenR 的直系同源蛋白，结合 pntR-gapR 间隔区，功能与 PenR 类似，可互补 penR 缺失。 |
| Streptomyces exfoliatus UC5319 | pentalenolactone 生物合成（pen 基因簇） | gapN | GapN | 催化 | 对 pentalenolactone 不敏感的甘油醛-3-磷酸脱氢酶，赋予自身抗性；其转录受 PenR 正调控。 |
| Streptomyces arenae TU469 | pentalenolactone 生物合成（pnt 基因簇） | gapR | GapR | 催化 | 同 GapN，为 pentalenolactone 不敏感 GAPDH，抗性基因。 |
| Streptomyces exfoliatus UC5319 | pentalenolactone 生物合成（pen 基因簇） | penH | PenH | 催化 | 非血红素铁/α-酮戊二酸依赖双加氧酶，催化 pentalenelactone 生物合成中的氧化步骤；其转录受 PenR 激活。 |
| Streptomyces exfoliatus UC5319 | pentalenolactone 生物合成（pen 基因簇） | penM | PenM | 催化 | P450 单加氧酶，催化 pentalenolactone F 氧化重排为 pentalenolactone 的最终步骤。 |
| Streptomyces arenae TU469 | pentalenolactone 生物合成（pnt 基因簇） | pntM | PntM | 催化 | PenM 同源蛋白，功能相同。 |
| Streptomyces exfoliatus UC5319 | pentalenolactone 生物合成（pen 基因簇） | penG | PenG | 转运 | 预测的跨膜外排泵，负责将 pentalenolactone 排出胞外。 |
| Streptomyces arenae TU469 | pentalenolactone 生物合成（pnt 基因簇） | pntG | PntG | 转运 | PenG 同源蛋白，预测的外排泵。 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 异源蛋白表达 | penR/pntR | PenR/PntR | 调控 | 用于生产重组 PenR 和 PntR 蛋白，供体外研究。 |
关键发现
- ['PenR 在体外与 penR-gapN 和 penM-penH 两个间隔区结合，PntR 只与 pntR-gapR 间隔区结合
- 结合位点被限定为保守的 37-bp DNA 片段。', 'PenR 结合 penR-gapN 靶点的表观 Kd 为 31±1 nM，结合 penM-penH 靶点为 16±1 nM
- PntR 结合 pntR-gapR 靶点为 9±1 nM。', 'pentalenolactone 可释放 PenR 与其两个靶点的结合，S0.5 均为 8±7 μM
- 释放 PntR 与其靶点结合的 S0.5 为 6±2 μM。pentalenolactone D 和 F 也可完全逆转蛋白-DNA 结合，而水杨酸无此作用。', 'penR 缺失突变株 S. exfoliatus ZD27 中 pentalenolactone 及其代谢中间体产量降至 GC-MS 检测限以下，经 penR 或 pntR 互补后恢复至野生型水平
- penM-penR 双突变株 ZD28 中 pentalenolactone F 产量大幅降低，互补后恢复。', 'RT-PCR 显示，与野生型相比，penR 突变株中抗性基因 gapN 和羟化酶基因 penH 的转录显著下降，而 penR 基因自身的转录水平升高。', 'xylE 报告基因测定显示 penM-penH 间隔区启动子活性为 15-30 mU/mg 蛋白，gapN 启动子活性为 4-15 mU/mg 蛋白，penR 启动子活性≤2 mU/mg 蛋白。', '重组 PenR 蛋白产量为 46 mg/L，PntR 为 13 mg/L。']
研究结论
PenR（及其同源蛋白 PntR）是 pentalenolactone 生物合成和自身抗性的正调控转录因子，同时作为 penR 转录的自抑制因子。细胞内 pentalenolactone 及其晚期生物合成中间体积聚到微摩尔浓度后作为配体，解除 PenR/PntR 对 DNA 的结合，从而形成产物介导的反馈调控回路。