Characterization of the Corynebacterium glutamicum ΔpimB' Δmgta Double Deletion Mutant and the Role of Mycobacterium tuberculosis Orthologues Rv2188c and Rv0557 in Glycolipid Biosynthesis
- 作者
- Arun K. Mishra, Sarah Batt, Karin Krumbach, Lothar Eggeling, Gurdyal S. Besra
- 单位
- School of Biosciences, University of Birmingham, Edgbaston, Birmingham B15 2TT, United Kingdom; Institute for Biotechnology 1, Research Centre Juelich, D-52425 Juelich, Germany
- 杂志
- Journal of Bacteriology（2009）
- DOI
- 10.1128/JB.01729-08
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
明确结核分枝杆菌糖基转移酶 Rv2188c 和 Rv0557 在糖脂生物合成中的真实功能，解决此前基于体外研究的功能注释混乱。
研究策略
构建谷氨酸棒杆菌 ΔpimB' ΔmgtA 双缺失突变体，分别异源过表达 Rv2188c 和 Rv0557，结合体内脂质/脂聚糖分析和体外酶活实验，确定二者的底物特异性和生物学功能。
核心内容
本研究通过构建谷氨酸棒杆菌ΔpimB' ΔmgtA双缺失突变体，并在其中分别异源表达结核分枝杆菌的Rv2188c和Rv0557，结合体内脂质谱分析与体外酶活实验，明确了这两个糖基转移酶的真实生物学功能。双敲除突变体生长速率由0.43 h⁻¹降至0.32 h⁻¹，且完全缺失Ac1PIM2与ManGlcAGroAc2，同时积累前体Ac1PIM1。回补Rv2188c可恢复Ac1PIM2合成及PI型脂聚糖LAM_Cg，但不恢复ManGlcAGroAc2；回补Rv0557则仅恢复ManGlcAGroAc2和LM-B_Cg。体外实验显示Rv2188c对Ac1PIM1底物特异性高，Rv0557底物谱较宽。据此将Rv2188c重新命名为PimBM（Ac1PIM1甘露糖基转移酶），Rv0557命名为MgtAM（GlcAGroAc2甘露糖基转移酶），修订了PIM生物合成途径，证明该双敲除菌株是解析分枝杆菌必需糖脂合成基因功能的有力工具。
创新点
首次在体内明确 Rv2188c 为 Ac1PIM1 甘露糖基转移酶、Rv0557 为 GlcAGroAc2 甘露糖基转移酶；重新命名 Rv2188c 为 PimBM、Rv0557 为 MgtAM；揭示了双敲除菌株的生长表型及糖脂合成缺陷。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Corynebacterium glutamicum | PIM生物合成 | pimB' | PimB'Cg | 催化 | 甘露糖基转移酶，催化Ac1PIM1生成Ac1PIM2；基因缺失导致Ac1PIM2缺失。 |
| Corynebacterium glutamicum | ManGlcAGroAc2生物合成 | mgtA | MgtACg | 催化 | 甘露糖基转移酶，催化GlcAGroAc2生成ManGlcAGroAc2；基因缺失导致ManGlcAGroAc2缺失。 |
| Corynebacterium glutamicum (异源表达) | PIM生物合成 | Rv2188c | Rv2188c | 催化 | 结核分枝杆菌直系同源蛋白，原称PimB'M，现重新命名为PimBM；在双敲除菌株中恢复Ac1PIM2合成，但不恢复ManGlcAGroAc2。 |
| Corynebacterium glutamicum (异源表达) | ManGlcAGroAc2生物合成 | Rv0557 | Rv0557 | 催化 | 结核分枝杆菌直系同源蛋白，原称PimBM，现重新命名为MgtAM；在双敲除菌株中恢复ManGlcAGroAc2合成，但不恢复Ac1PIM2。 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | PIM生物合成 | pimB'Cg | PimB'Cg (His-tagged) | 催化 | 重组表达并纯化用于体外酶活分析，验证其催化Ac1PIM1生成Ac1PIM2。 |
关键发现
- 构建的 C. glutamicum ΔpimB' ΔmgtA 双缺失突变体在指数期生长速率从
- 43 h^-1 降至
- 32 h^-1；该突变体完全缺失 Ac1PIM2 和 ManGlcAGroAc2，同时积累 Ac1PIM1（m/z 1236 [M-H]^-，含 C16/C18:1 脂肪酸）。回补 Rv2188c 可恢复 Ac1PIM2 合成（m/z 1398）和 PI 型脂聚糖 LAM_Cg 合成，但不恢复 ManGlcAGroAc2 和 LM-B_Cg；回补 Rv0557 仅恢复 ManGlcAGroAc2（m/z 977）和 LM-B_Cg，不恢复 Ac1PIM2。体外酶活实验显示，Rv2188c 对 Ac1PIM1 底物特异性高，对 GlcAGroAc2 有弱活性；Rv0557 对 Ac1PIM1 和 GlcAGroAc2 均有宽松的底物特异性。纯化的重组 PimB'Cg 能催化 Ac1PIM1 生成 Ac1PIM2。
研究结论
Rv2188c 和 Rv0557 在结核分枝杆菌中分别编码 Ac1PIM1 甘露糖基转移酶（重新命名为 PimBM）和 GlcAGroAc2 甘露糖基转移酶（重新命名为 MgtAM），修订了 PIM 生物合成途径，表明 C. glutamicum 双敲除菌株是研究分枝杆菌必需糖脂合成基因功能的有效工具。