Biochemical Characterization of a Novel Indole Phenyltransferase from Streptomyces sp. SN-593
- 作者
- Shunji Takahashi, Hiroshi Takagi, Atsushi Toyoda, Masakazu Uramoto, Toshihiko Nogawa, Masashi Ueki, Yoshiyuki Sakaki, Hiroyuki Osada
- 单位
- Chemical Biology Department, Advanced Science Institute, RIKEN, Saitama 351-0198, Japan; Comparative Genomics Laboratory, National Institute of Genetics, Shizuoka 411-8540, Japan; Toyohashi University of Technology, Aichi 441-8580, Japan
- 杂志
- Journal of Bacteriology（2010）
- DOI
- 10.1128/JB.01557-09
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
从Streptomyces sp. SN-593中鉴定并表征催化吲哚环C-6位二甲基烯丙基转移的新型吲哚异戊烯基转移酶IptA；此酶此前在自然界中未见报道。
研究策略
采用代谢物引导的基因组挖掘策略：先分离新天然产物6-DMAI-3-carbaldehyde，再通过同源搜索在基因组中找到候选基因iptA，结合异源表达、生化表征和基因敲除验证其功能。
核心内容
该研究从Streptomyces sp. SN-593中鉴定并表征了一种新型吲哚异戊烯基转移酶IptA，其催化吲哚环C-6位的二甲基烯丙基转移反应，该催化活性在自然界中此前未见报道。研究采用代谢物引导的基因组挖掘策略，首先从10升培养物中分离出新化合物6-DMAI-3-carbaldehyde（产量4.2 mg）及6-二甲基烯丙基-L-色氨酸（产量1.3 mg），随后通过同源搜索锁定候选基因iptA，并经异源表达、生化表征和基因敲除验证其功能。IptA重组蛋白为41.3 kDa的单体，对L-色氨酸的Km为9.4 μM，kcat为57.6 min⁻¹，特异利用DMAPP作为异戊烯基供体，不依赖金属离子。底物谱分析显示其具有杂泛性，对5-羟基-L-色氨酸和α-甲基-DL-色氨酸的相对活性分别达109.8%和106%，可生成多种新型6-异戊烯基吲哚衍生物。iptA敲除突变株完全丧失目标产物合成能力，证实其体内功能。该酶作为链霉菌中首个被鉴定的吲哚异戊烯基转移酶，其底物杂泛性为化学酶法合成新型吲哚衍生物提供了有力工具。
创新点
['首次鉴定催化吲哚C-6位二甲基烯丙基转移的酶IptA', '通过代谢物引导的基因组挖掘发现隐蔽基因，将代谢物与基因功能关联', 'IptA具有底物杂泛性，能够产生多种新型6-二甲基烯丙基吲哚化合物', '揭示了细菌来源吲哚异戊烯基转移酶的一个新分支']
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Streptomyces sp. SN-593 | 6-二甲基烯丙基吲哚生物合成 | iptA | IptA | 催化 | 催化DMAPP二甲基烯丙基转移到L-色氨酸或吲哚衍生物的C-6位，也微弱作用于吲哚-3-甲醛 |
| E. coli BL21 Star (DE3) | 异源表达 | iptA | IptA | 催化 | 用于重组表达和酶学表征 |
关键发现
- ['从Streptomyces sp. SN-593培养液中分离并鉴定了新化合物6-DMAI-3-carbaldehyde，10升培养物产量为4.2 mg
- 同时检测到6-二甲基烯丙基-L-色氨酸，产量为1.3 mg/10 L。', 'iptA基因全长1158 bp，编码385个氨基酸的蛋白（分子量41.3 kDa），与蓝细菌LtxC的氨基酸一致性为27%，与SAML0654（60%）和SCO7467（58%）同源，系统发育分析表明其构成独立分支。', 'IptA重组蛋白为单体（40 kDa），对L-色氨酸的Km为9.4±0.9 μM，kcat为57.6±0.9 min⁻¹，催化效率为6.13 min⁻¹ μM⁻¹
- 对DMAPP在L-Trp存在下Km为6.2±0.8 μM，kcat为70.7±1.6 min⁻¹。', 'IptA特异地以DMAPP为异戊烯基供体，不能利用GPP/FPP/GGPP
- 金属离子不依赖，EDTA不抑制活性
- 最适pH 7.0–9.5，50 ℃处理5分钟失活，活化能46 kJ/mol。', '底物特异性分析显示，IptA对α-甲基-DL-色氨酸（106%相对活性）、L-abrine（51.2%）、5-羟基-L-色氨酸（109.8%）等均有活性，并产生多种新型6-二甲基烯丙基吲哚化合物（如5-羟基-6-二甲基烯丙基-L-色氨酸等）。', 'iptA基因敲除突变株完全丧失6-DMAI-3-carbaldehyde和6-二甲基烯丙基-L-色氨酸的产生，证实iptA参与这两种代谢物的生物合成。']
研究结论
IptA是从链霉菌中鉴定到的第一个吲哚异戊烯基转移酶，作为6-二甲基烯丙基-L-色氨酸合酶（6-DMATS）发挥作用。其底物杂泛性使其可作为化学酶法合成和天然产物途径工程的有力工具，用于生产新型6-异戊烯基吲哚衍生物。