Involvement of CarA/LitR and CRP/FNR Family Transcriptional Regulators in Light-Induced Carotenoid Production in Thermus thermophilus††
- 作者
- Hideaki Takano, Masato Kondo, Noriyoshi Usui, Toshimitsu Usui, Hiromichi Ohzeki, Ryuta Yamazaki, Misato Washioka, Akira Nakamura, Takayuki Hoshino, Wataru Hakamata, Teruhiko Beppu, Kenji Ueda
- 单位
- Life Science Research Center, College of Bioresource Sciences, Nihon University, Fujisawa; Division of Integrative Environmental Sciences, Graduate School of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba, Tsukuba; Department of Chemistry and Life Science, College of Bioresource Sciences, Nihon University, Fujisawa, Japan
- 杂志
- Journal of Bacteriology（2011）
- DOI
- 10.1128/JB.01125-10
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
阐明极端嗜热菌Thermus thermophilus中光诱导类胡萝卜素生物合成的转录调控机制，特别是CarA/LitR家族和CRP/FNR家族转录调控因子的作用。
研究策略
采用基因敲除、遗传互补、S1核酸酶作图、凝胶阻滞、DNase I足迹和体外转录等遗传与生化手段，解析LitR和TTP55对光依赖性类胡萝卜素合成基因表达的调控机制。
核心内容
该研究以极端嗜热菌Thermus thermophilus HB27为对象，探究光诱导类胡萝卜素合成的转录调控机制。通过基因敲除、遗传互补及系列生化实验，发现该菌类胡萝卜素产生受蓝光（400–460 nm）诱导，暗处几乎不合成。litR基因敲除后光照和暗处均产生类胡萝卜素，而TTP55敲除则完全丧失合成能力。钴胺素合成基因簇敲除突变体在暗处也能产生类胡萝卜素，添加0.1 mM甲基钴胺素可恢复光依赖性。LitR以二聚体形式结合crtB和litR之间双向启动子区域的倒置重复序列（–55至–94区域），抑制PlitR和PcrB转录；其C末端（aa165–273）负责结合钴胺素，光照可能通过钴胺素介导LitR去抑制。体外转录证明TTP55作为激活因子促进PcrB转录，但依赖–51至+1区域，其中–47和–49位点突变可消除激活。研究揭示了光信号经由钴胺素-LitR-TTP55级联调控类胡萝卜素合成与DNA修复的工作模型，为理解细菌光适应机制提供了新视角。
创新点
首次发现T. thermophilus的类胡萝卜素产生受光诱导；证明LitR直接结合双向启动子区域并抑制转录，TTP55作为激活因子；证实钴胺素（Cbl）结合LitR的C末端结构域是光依赖性调控的关键。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Thermus thermophilus HB27 | 类胡萝卜素生物合成途径 | — | — | — | 模式菌株，用于光诱导类胡萝卜素产生的表型分析和基因敲除 |
| Thermus thermophilus | 光诱导转录调控 | litR (TT_P0056) | LitR | 调控 | CarA/LitR家族MerR型转录调控因子，含C末端钴胺素结合域，结合双向启动子区域抑制转录 |
| Thermus thermophilus | 光诱导转录调控 | TTP55 (TT_P0055) | TTP55 | 调控 | CRP/FNR家族转录调控因子，激活crtB启动子，不依赖cAMP |
| Thermus thermophilus | 类胡萝卜素生物合成途径 | crtB (TT_P0057) | 八氢番茄红素合成酶 | 催化 | 类胡萝卜素合成的关键酶，其启动子受光诱导 |
| Thermus thermophilus | 光修复/DNA损伤修复 | phr (TT_P0058) | DNA光裂合酶 | 催化 | 位于crtB操纵子中，参与光诱导的DNA修复 |
| Thermus thermophilus | 钴胺素生物合成 | cob cluster (TT_P0001-0023) | 钴胺素合成酶 | 调控 | 提供LitR的配体钴胺素，缺失导致光依赖性丧失 |
关键发现
- 野生型菌株在光照下产生黄色类胡萝卜素，暗处几乎不产生
- 蓝光（400-460 nm）诱导而红光不诱导。吸收光谱在450 nm附近呈现典型类胡萝卜素特征峰。litR基因敲除突变体在光照和暗处均产生类胡萝卜素，TTP55敲除突变体则不产生。钴胺素合成基因簇（cob）敲除突变体在暗处也产生类胡萝卜素，添加0.1 mM甲基钴胺素可恢复光依赖性。S1分析显示PcrB活性受光诱导，PlitR在光照和暗处无明显差异
- litR突变体中PlitR活性显著上调。转录起始位点：PlitR起始于LitR翻译起始密码子ATG的第一个A，PcrB起始于CrtB翻译起始密码子上游4 bp的A。LitR以二聚体形式存在，其C末端（aa165-273）与钴胺素结合。DNase I足迹显示LitR保护PcrB转录起点上游-55至-94区域，该区域包含一个倒置重复ATGTATA...(16 bp)...TGTACAT。体外转录实验证明TTP55可激活PcrB转录，但需要-51至+1区域
- 将-47和-49位点T突变为G后激活消失
- LitR重组蛋白可抑制TTP55依赖的PcrB转录。
研究结论
提出T. thermophilus光诱导类胡萝卜素合成的工作模型：LitR蛋白结合litR和crtB之间的双向启动子区域，负调控PlitR和PcrB；光照可能通过钴胺素介导LitR去抑制，进而表达TTP55；TTP55作为激活因子促进crtB操纵子的转录，从而启动类胡萝卜素生物合成和DNA修复系统。