The role and function of LitR, an AdoB12- bound light- sensitive regulator of Bacillus megaterium QM B1551, in the regulation of carotenoid production
- 作者
- Hideaki Takano, Kou Mise, Kenta Hagiwara, Naoya Hirata, Shoko Watanabe, Minami Toriyabe, Hatsumi Shiratori-Takano, Kenji Ueda
- 单位
- Life Science Research Center, College of Bioresource Sciences, Nihon University
- 杂志
- Journal of Bacteriology
- DOI
- 10.1128/JB.02528-14
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
阐明革兰氏阳性菌Bacillus megaterium QM B1551中AdoB12结合的光敏转录调控因子LitR在光诱导类胡萝卜素生产中的角色与功能
研究策略
采用基因敲除、遗传互补、异源表达、RT-PCR、凝胶阻滞分析、DNase I足迹、体外转录、凝胶过滤和分析超速离心等遗传与生化手段解析LitR的调控机制
核心内容
本研究以革兰氏阳性菌Bacillus megaterium QM B1551为对象，系统解析了AdoB12结合的光敏转录调控因子LitR在光诱导类胡萝卜素生产中的功能。通过基因敲除、凝胶阻滞、DNase I足迹、体外转录和凝胶过滤等手段，证明LitR与AdoB12形成复合物，在黑暗中以四聚体形式（Mr约139,000）结合litR自身启动子和crt操纵子启动子，抑制转录；光照3分钟（100 μmol s⁻¹ m⁻²）即可导致其解离为二聚体（Mr约89,000）并丧失DNA结合活性，从而解除抑制、启动类胡萝卜素合成。DNase I足迹确定了两个启动子上的结合位点及共有序列5'-TG(T/A)A(C/T)A-N₁₆-T(G/A)TA(C/T)A-3'。体外转录表明仅AdoB12能赋予抑制活性，且365 nm、450 nm、530 nm光可诱导转录而633 nm无效，与AdoB12吸收光谱一致。ΔBMQ_1998突变体在光照和黑暗下仅产生弱类胡萝卜素，证实AdoB12合成对光调控至关重要。该研究首次对革兰氏阳性菌来源的LitR/CarH家族蛋白进行系统生化分析，揭示了光诱导亚基解离是解除转录抑制的核心机制，表明这一调控模式在革兰氏阳性菌中同样保守。
创新点
首次对革兰氏阳性菌来源的LitR/CarH家族蛋白进行系统的生化分析；证明B. megaterium的LitR与AdoB12形成的复合物作为光敏转录抑制因子，直接调控crt操纵子和自身启动子的转录，且光诱导的亚基解离是解除抑制的关键
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Bacillus megaterium QM B1551 | 类胡萝卜素生物合成 | litR (BMQ_4356) | LitR | 调控 | AdoB12结合的光敏转录抑制因子，负调控crt操纵子和自身转录 |
| Bacillus megaterium QM B1551 | 类胡萝卜素生物合成 | crtI1 (BMQ_0654), crtI2 (BMQ_0655), crtB (BMQ_0656) | CrtI1, CrtI2, CrtB | 催化 | 参与番茄红素生物合成，crt操纵子 |
| Bacillus megaterium QM B1551 | 类胡萝卜素生物合成 | BMQ_1998 | 腺苷钴啉胺-GDP核糖转移酶 | 催化 | 参与AdoB12生物合成，其缺失导致光诱导类胡萝卜素生产减弱 |
| Bacillus subtilis 168 | 光调控（异源表达） | litR | LitR | 调控 | 异源宿主中验证LitR的光敏调控功能 |
| Bacillus subtilis 168 | B12摄取与AdoB12合成 | yvqK | YvqK | 催化 | ATP:cob(I)alamin adenosyltransferase，催化AdoB12合成的最后一步 |
| Bacillus subtilis 168 | B12摄取与AdoB12合成 | yvrA, yvrB, yvrC | YvrABC转运体 | 转运 | 假定的B12摄取转运体 |
| Bacillus megaterium QM B1551 | 基础转录 | sigA | SigA (σA) | 调控 | RNA聚合酶主要σ因子，负责litR和crt启动子的转录起始 |
| Escherichia coli Rosetta2(DE3)pLysS | 异源蛋白表达 | litR, sigA | LitR, SigA | 调控 | 用于重组蛋白过量表达与纯化 |
关键发现
- ['光照诱导B. megaterium QM B1551产生类胡萝卜素，ΔlitR突变体在黑暗和光照下均大量产生类胡萝卜素，表明LitR是负调控因子', 'AdoB12-LitR在黑暗下以四聚体形式存在（Mr约139,000），光照下解离为二聚体（Mr约89,000）
- Apo-LitR无光敏感性', '凝胶阻滞试验表明，AdoB12-LitR在黑暗中结合PlitR和PcrtI1，至少3分钟光照（100 μmol s⁻¹ m⁻²）可使其完全丧失DNA结合活性', "DNase I footprint确定LitR结合位点：PlitR保护区域为-36至-67，PcrtI1为-13至+22
- 共有序列为5'-TG(T/A)A(C/T)A-N₁₆-T(G/A)TA(C/T)A-3'", '体外转录试验显示，随AdoB12-LitR蛋白量增加（0-8 pmol），EσA催化的litR和crtI1转录显著降低，光照解除抑制
- 只有AdoB12能赋予抑制活性，OHB12、CNB12、MeB12无效', '波长365 nm、450 nm、530 nm光可诱导转录，633 nm光无效
- 与AdoB12吸收光谱一致', 'LB培养基含0.2 ng/ml Cbl，B. subtilis培养后降至0.1 ng/ml，表明胞内AdoB12合成依赖YvqK等基因', 'ΔBMQ_1998（腺苷钴啉胺-GDP核糖转移酶）突变体在光照和黑暗下均仅产生弱类胡萝卜素，表明AdoB12合成对光调控至关重要']
研究结论
B. megaterium QM B1551的LitR蛋白与AdoB12结合形成光敏转录抑制因子，在黑暗中通过与litR和crt操纵子启动子结合抑制其转录；光照引起AdoB12光解和LitR四聚体解离为二聚体，丧失DNA结合能力，RNA聚合酶σA识别启动子并启动类胡萝卜素合成基因表达。该机制在革兰氏阳性菌中同样保守，是LitR/CarH家族调控光诱导类胡萝卜素生产的普遍模式。