Metabolic Flux Ratio Analysis of Genetic and Environmental Modulations of Escherichia coli Central Carbon Metabolism
- 作者
- UWE SAUER, DANIEL R. LASKO, JOCELYNE FIAUX, MICHEL HOCHULI, RALF GLASER, THOMAS SZYPERSKI, KURT WUTHIRICH, JAMES E. BAILEY
- 单位
- Institut für Biotechnologie, ETH Zürich; Institut für Molekularbiologie und Biophysik, ETH Zürich
- 杂志
- Journal of Bacteriology（1999）
- DOI
- 10.1128/JB.181.21.6679-6688.1999
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
应用新发展的代谢通量比（METAFoR）分析方法，研究遗传和环境扰动对大肠杆菌中心碳代谢通量分布和代谢途径活性的影响，检验代谢网络的鲁棒性与可塑性。
研究策略
利用基于二维13C-1H相关NMR的METAFoR技术，对不同遗传背景（野生型、基因敲除、基因过表达）的大肠杆菌菌株在不同培养条件（碳限制、氮限制、好氧/厌氧、批次/恒化）下的中心碳代谢进行通量比例分析，并结合生理参数测定。
核心内容
本研究将新发展的代谢通量比（METAFoR）分析技术系统应用于大肠杆菌中心碳代谢的遗传与环境调控研究。该方法基于二维13C-1H相关NMR，对野生型、基因敲除及过表达菌株在碳限制、氮限制、好氧/厌氧及不同培养模式下的通量比例进行解析。结果显示，氨限制恒化培养中PEP经转酮醇酶反应的比例较葡萄糖限制降低50%，厌氧回补途径中OAA来自PEP的比例从约40%增至70%；厌氧批次培养中OAA几乎全部（>98%）来自PEP。遗传扰动方面，丙酮酸激酶双敲除菌PB25的好氧比生长速率（0.64/h）反超亲本，且产乙醇菌株KO20的乙醇生成速率达118 mmol/g/h，远高于亲本的27 mmol/g/h。然而，所有酶过表达菌株的通量比例与对照基本一致，揭示大肠杆菌中心碳代谢对遗传扰动表现出显著鲁棒性，其可塑性主要体现于应对环境条件变化时TCA循环与厌氧回补通量的调整。该工作首次直接鉴定了PEP羧化酶和苹果酸酶的在体活性，并揭示了葡萄糖限制下无效循环的存在，为代谢工程提供了传统方法难以获取的隐蔽代谢通量信息。
创新点
首次将METAFoR分析系统应用于大肠杆菌中心碳代谢的遗传与环境调控研究；直接鉴定了常被认为在葡萄糖培养中不活跃的PEP羧化酶和苹果酸酶的在体活性；揭示了葡萄糖限制条件下特定无效循环活性放松调控的现象。
研究对象（10）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli KO20 | 糖酵解 | pfkA | 6-磷酸果糖激酶-1 | 催化 | 在KO20中通过pPPec质粒过表达，未引起通量比例显著变化。 |
| Escherichia coli JM101/PB25 | 糖酵解 | pykF, pykA | 丙酮酸激酶I/II | 催化 | 在PB25中双敲除，导致OAA来自PEP比例增加等通量比例变化。 |
| Escherichia coli KO20 | 乙醇发酵 | pdc（Zymomonas mobilis） | 丙酮酸脱羧酶 | 催化 | 由pet操纵子编码，插入染色体，用于乙醇生产。 |
| Escherichia coli KO20 | 乙醇发酵 | adhB（Zymomonas mobilis） | 醇脱氢酶II | 催化 | 由pet操纵子编码，插入染色体，用于乙醇生产。 |
| Escherichia coli KO20 | 厌氧混合酸发酵 | pfl | 丙酮酸甲酸裂解酶 | 催化 | 在KO20中被pet操纵子插入破坏，阻断甲酸生成。 |
| Escherichia coli MG1655 | 厌氧回补反应 | ppc | 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 | 催化 | METAFoR分析鉴定其在葡萄糖培养中活跃，催化PEP生成OAA。 |
| Escherichia coli MG1655 | 糖异生 | pckA | 磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶 | 催化 | 在葡萄糖限制恒化培养中检测到活性，参与PEP羧化酶循环。 |
| Escherichia coli MG1655 | 丙酮酸代谢 | maeA, maeB | 苹果酸酶 | 催化 | METAFoR分析显示其低活性，催化MAL生成PYR。 |
| Escherichia coli | 戊糖磷酸途径 | tktA, tktB | 转酮醇酶 | 催化 | 氨限制条件下相关通量比例降低50%，参与非氧化性戊糖磷酸途径。 |
| Escherichia coli | 戊糖磷酸途径 | talA, talB | 转醛醇酶 | 催化 | 参与戊糖磷酸途径的交换反应，各条件下通量比例相对稳定。 |
关键发现
- 氨限制恒化培养相比葡萄糖限制，PEP分子经至少一次转酮醇酶反应的比例降低50%，OAA来自PEP的厌氧回补比例从约40%增至约70%，而PEP来自OAA的比例显著下降
- 厌氧批次培养中OAA几乎全部（>98%）来自PEP
- 丙酮酸激酶双敲除菌PB25的好氧比生长速率（0.64/h）高于亲本JM101（0.60/h），并表现为较高的OAA来自PEP和PYR来自MAL比例
- 产乙醇菌株KO20在厌氧条件下乙醇生成速率达118 mmol/g/h，乙酸39 mmol/g/h，而亲本ATCC11303分别为27和54 mmol/g/h
- 不同收获时间（对数中期、对数后期、稳定期）的批次培养METAFoR模式高度一致
- 所有酶过表达菌株的通量比例与对照基本一致，显示中心碳代谢对遗传扰动的鲁棒性。
研究结论
大肠杆菌中心碳代谢在基因过表达和敲除等遗传扰动下保持显著的通量比例稳定，但在环境条件改变时，尤其涉及TCA循环和厌氧回补的通量发生较大变化；METAFoR分析能够揭示传统方法难以检测的隐蔽代谢反应和无效循环，为代谢工程提供重要的通量信息。