Cloning, Solubilization, and Characterization of Squalene Synthase from Thermosynechococcus elongatus BP-1
- 作者
- Sungwon Lee, C. Dale Poulter
- 单位
- Department of Chemistry, University of Utah, 315 South 1400 East, Salt Lake City, Utah 84112
- 杂志
- Journal of Bacteriology（2008）
- DOI
- 10.1128/JB.01939-07
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
从产藿烷的嗜热蓝藻 Thermosynechococcus elongatus BP-1 中获得可溶、有活性的细菌角鲨烯合酶（SQS），并对其进行克隆、纯化和生化表征，以填补细菌 SQS 研究的空白。
研究策略
将 T. elongatus BP-1 的 SQS 基因（tll1096）克隆进 pET28b(+) 载体，在大肠杆菌 Rosetta(DE3) 中表达 His6 标签融合蛋白；通过对裂解和纯化缓冲液添加 20%~50% 甘油、降低表达温度至 30°C 等优化，获得可溶性活性酶；再经 Ni-NTA 亲和纯化后进行酶学表征。同时尝试了 B. japonicum 和 Z. mobilis 的 SQS 可溶表达但未成功。
核心内容
该研究首次从产藿烷的嗜热蓝藻Thermosynechococcus elongatus BP-1中克隆并表达了细菌来源的角鲨烯合酶（SQS），填补了细菌SQS生化表征的空白。作者将tll1096基因克隆至pET28b(+)载体，在大肠杆菌Rosetta(DE3)中表达His6标签融合蛋白。由于该酶表达时主要形成包涵体，通过在裂解和纯化缓冲液中添加20%至50%甘油并降低表达温度至30°C，成功获得可溶性活性酶，占胞质总蛋白约3%至6%，纯化后纯度超过97%。 纯化后的SQS以法尼基焦磷酸（FPP）和NADPH为底物生成角鲨烯，无NADPH时生成前角鲨烯焦磷酸（PSPP）。该酶依赖Mg²⁺，最适pH为7.6，最适温度为60°C，动力学参数为Km(FPP)=0.97 μM，kcat=1.74 s⁻¹，可被zaragozic acid A有效抑制（IC50=95.5 nM）。序列分析显示该酶与真核SQS约30%相似，但缺乏真核酶的C端跨膜锚定螺旋。这项工作为研究细菌藿烷生物合成提供了关键工具，其高甘油可溶化策略也为其他难溶膜相关酶的表达提供了借鉴。
创新点
首次报道细菌源 SQS（来自 T. elongatus BP-1）的可溶性重组表达与纯化；发现高浓度甘油是实现该酶可溶化的关键，且蛋白一旦可溶化后无需甘油也能保持活性；系统比较了细菌 SQS 与真核 SQS 的序列和动力学性质。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Thermosynechococcus elongatus BP-1 | 藿烷生物合成 | tll1096 | squalene synthase (SQS) | 催化 | 天然来源，SQS 催化两分子 FPP 缩合生成 PSPP，再经 NADPH 依赖的重排还原生成角鲨烯。 |
| Escherichia coli Rosetta(DE3) | 藿烷/甾醇生物合成（异源表达） | tll1096 | His6-tagged T. elongatus SQS | 催化 | 重组表达获得可溶性活性酶，需在裂解和纯化缓冲液中添加 20%~50% 甘油。 |
| Bradyrhizobium japonicum USDA 110 | 藿烷生物合成 | blr3001（长版）及短版 SQS 基因 | squalene synthase (SQS) | 催化 | 克隆到大肠杆菌表达系统，但未能获得可溶性活性蛋白。 |
| Zymomonas mobilis ZM4 | 藿烷生物合成 | zmo0869 | squalene synthase (SQS) | 催化 | 克隆到大肠杆菌表达系统，但未能获得可溶性活性蛋白。 |
| Escherichia coli | 类异戊二烯前体生物合成 | — | farnesyl diphosphate synthase (FPP synthase) | 催化 | 重组 E. coli FPP synthase 用于从 [14C]IPP 和 GPP 合成 [14C]FPP，以检测 PSPP 的形成。 |
关键发现
- 重组 T. elongatus BP-1 SQS 在大肠杆菌中表达时主要形成包涵体，通过在裂解/纯化缓冲液中加入 20%~50% 甘油并降低表达温度至 30°C，获得占胞质总蛋白约 3%~6% 的可溶性活性酶
- 纯化后蛋白纯度 >97%，SDS-PAGE 表观分子量约 42 kDa，ESI-MS 实测 m/z 41886（理论值 41888，去除 N 端 Met）。酶以 FPP 和 NADPH 为底物生成角鲨烯
- 无 NADPH 时生成 PSPP。酶需 Mg2+，最适 pH 7.6，最适温度 60°C，Tween 80 最适浓度 2%（vol/vol）。动力学参数：Km(FPP)=0.97±0.10 μM，kcat=1.74±0.04 s^-1，Km(NADPH)=241±13 μM，kcat/Km(FPP)=1.80±0.02 μM^-1 s^-1。Zaragozic acid A 的 IC50=95.5±13.6 nM。B. japonicum 和 Z. mobilis 的 SQS 均未能获得可溶活性蛋白。
研究结论
T. elongatus BP-1 的 tll1096 基因编码角鲨烯合酶，该酶与真核 SQS 约 30% 相似，保守的催化区域 I/II 高度同源，且缺乏真核酶的 C 端跨膜锚定螺旋。通过高浓度甘油缓冲液可实现该细菌 SQS 的可溶化与纯化。其酶学性质（金属离子、pH、动力学常数）与真核 SQS 相似，且可被 zaragozic acid A 有效抑制，表明该酶是研究细菌藿烷合成的重要工具。