L-Sorbose Reductase and Its Transcriptional Regulator Involved in L-Sorbose Utilization of Gluconobacter frateurii
- 作者
- Wichai Soemphol, Hirohide Toyama, Duangtip Moonmangmee, Osao Adachi, Kazunobu Matsushita
- 单位
- Department of Biological Chemistry, Faculty of Agriculture, Yamaguchi University; Applied Molecular Bioscience, Graduate School of Medicine, Yamaguchi University; Department of Microbiology, Faculty of Science, King Mongkut's University of Technology Thonburi
- 杂志
- Journal of Bacteriology（2007）
- DOI
- 10.1128/JB.01895-06
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解析Gluconobacter frateurii THD32中参与L-山梨糖利用的NADPH依赖性L-山梨糖还原酶（SboA）及其转录调控因子（SboR）的功能与调控机制。
研究策略
克隆sboR和sboA基因并进行序列分析；构建sboR和sboA基因敲除突变株，比较生长和酶活性差异；在大肠杆菌中异源表达并纯化SboA，表征其酶学性质；通过RT-PCR确认sboR和sboA的共转录关系；利用互补实验验证SboR对SboA表达的抑制作用。
核心内容
该研究解析了Gluconobacter frateurii THD32中L-山梨糖利用的关键酶及其调控机制。研究者克隆了sboA和sboR基因，通过基因敲除、异源表达、酶学表征和RT-PCR等手段，鉴定出SboA为分子量约29 kDa的NADPH依赖性L-山梨糖还原酶，属于短链脱氢酶/还原酶家族；SboR则属于AraC/XylS家族转录因子。纯化的SboA还原L-山梨糖比活性达95.70 U/mg，Km为167 mM。sboA敲除株在L-山梨糖培养基上生长严重受损，sboR敲除株在两种糖上生长均优于野生型且胞内酶活性显著升高，证实SboR作为阻遏蛋白抑制sboRA操纵子表达，而L-山梨糖可能作为去阻遏诱导物。此外还发现，该操纵子的诱导可能还需另一个未鉴定的激活因子参与。该工作首次揭示了Gluconobacter属中L-山梨糖同化的转录调控机制，为利用该菌株进行维生素C前体生产提供了分子改造靶点。
创新点
首次报道Gluconobacter属中L-山梨糖同化作用的转录调控机制；发现SboR属于AraC/XylS家族但作为阻遏蛋白发挥功能，不同于该家族典型的转录激活子；鉴定SboA为一种分子量约29 kDa的NADPH-SR，属于短链脱氢酶/还原酶家族，与已知的60 kDa NADPH-SR在分子大小和氨基酸序列上均不同。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Gluconobacter frateurii THD32 | L-山梨糖利用/山梨醇代谢 | sboA | SboA (NADPH依赖性L-山梨糖还原酶，EC 1.1.1.289) | 催化 | 催化L-山梨糖还原为D-山梨醇，是L-山梨糖同化的关键酶；属于短链脱氢酶/还原酶家族，亚基约29 kDa。 |
| Gluconobacter frateurii THD32 | L-山梨糖利用调控 | sboR | SboR (AraC/XylS家族转录调控因子) | 调控 | 作为阻遏蛋白抑制sboRA操纵子的表达；L-山梨糖可能作为诱导物解除其阻遏作用。 |
| Gluconobacter frateurii THD32 | D-山梨醇氧化 | sldSLC | FAD依赖性D-山梨醇脱氢酶 (FAD-SLDH) | 催化 | 膜结合脱氢酶，催化D-山梨醇氧化为L-山梨糖；其表达不受SboR影响。 |
| Gluconobacter frateurii THD32 | D-山梨醇氧化 | — | PQQ-甘油脱氢酶 (PQQ-GLDH) | 催化 | 膜结合多醇脱氢酶，也可氧化D-山梨醇生成L-山梨糖。 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 异源表达 | sboA | SboA | 催化 | 利用T7启动子在大肠杆菌中表达并纯化SboA，用于酶学性质表征。 |
关键发现
- SboA的亚基分子量约29 kDa（理论计算28,320 Da），天然分子量87 kDa
- 纯化的SboA对L-山梨糖还原的比活性为95.70 U/mg，对D-山梨醇氧化的比活性为11.38 U/mg
- Km为167 mM，Vmax为250 U/mg
- 最适pH分别为还原L-山梨糖pH 6-7、氧化D-山梨醇pH 10
- sboA基因敲除突变株在L-山梨糖培养基上生长严重受损，在D-山梨醇上生长也部分受损
- sboR敲除突变株在D-山梨醇和L-山梨糖上生长优于野生型，且细胞质NADPH-SR活性显著升高
- RT-PCR证明sboR和sboA共转录组成操纵子
- SboR过表达抑制L-山梨糖消耗，而sboA互补恢复生长。
研究结论
SboA是Gluconobacter frateurii中负责L-山梨糖同化的NADPH依赖性L-山梨糖还原酶，对高效利用L-山梨糖是必需的；SboR是AraC/XylS家族的转录阻遏蛋白，直接抑制sboRA操纵子的表达，L-山梨糖可能作为去阻遏诱导物；D-山梨醇或L-山梨糖对sboRA的诱导还需要另一个未鉴定的转录激活因子参与。