The lytB Gene of Escherichia coli Is Essential and Specifies a Product Needed for Isoprenoid Biosynthesis
- 作者
- SEAN MCTEER, ANDREW COULSON, NEIL McLENNAN, MILLICENT MASTERS
- 单位
- Institute of Cell and Molecular Biology, University of Edinburgh, Edinburgh EH9 3JR, Scotland
- 杂志
- Journal of Bacteriology（2001）
- DOI
- 10.1128/JB.183.24.7403-7407.2001
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
阐明大肠杆菌lytB基因的功能，并验证其是否参与异戊二烯（类异戊二烯）生物合成以及是否为必需基因。
研究策略
通过条件基因敲除（利用阿拉伯糖启动子P_BAD调控lytB表达）、基因互补实验、表型观察及添加可能的通路中间体类似物（异戊烯醇类似物）等手段，研究lytB缺失对细胞生长和裂解的影响，并结合生物信息学结构预测推断LytB和GcpE的可能生化功能。
核心内容
该研究通过条件基因敲除策略阐明了大肠杆菌lytB基因的功能。利用阿拉伯糖启动子P_BAD调控lytB表达，研究发现该基因缺失后细胞生长约3小时仍保持正常，随后逐渐减慢，约4.6小时后发生细胞裂解。转导实验证实，只有在提供lytB表达的条件下才能获得223个Cmp抗性转导子，不提供时仅得到少数假阳性，证明lytB是大肠杆菌存活所必需的基因。添加10 mM的3-甲基-3-丁烯-1-醇或3-甲基-2-丁烯-1-醇可延迟裂解并支持有限生长，其中前者效果更优，这为LytB参与DOXP途径提供了生理证据。结构预测显示LytB和GcpE均为α/β球状蛋白，GcpE可能具有8条链的TIM桶结构，两者可能催化该途径最后步骤中的消除反应。这些结果明确将lytB与类异戊二烯前体IPP/DMAPP的生成联系起来，为理解非甲羟戊酸途径的末端步骤提供了关键线索。
创新点
首次通过条件突变体证明大肠杆菌lytB基因是存活所必需的，且其缺失导致细胞裂解，直接关联到异戊二烯生物合成；通过添加异戊烯醇类似物部分缓解裂解为LytB参与DOXP途径提供了生理证据；基于结构预测提出LytB和GcpE可能为TIM桶状蛋白并推测其催化消除反应。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | 非甲羟戊酸途径（DOXP途径） | lytB | LytB | 催化 | 必需基因，推测参与异戊二烯生物合成最后步骤（如还原或消除反应），缺失导致细胞裂解。 |
| Escherichia coli | 非甲羟戊酸途径（DOXP途径） | gcpE | GcpE | 催化 | 预测为TIM桶状蛋白，与LytB共同参与IPP/DMAPP生成最后步骤。 |
| Escherichia coli | 非甲羟戊酸途径（DOXP途径） | fkpB | FkpB | 催化 | 肽基脯氨酰顺反异构酶，非必需，与lytB共转录。 |
| Escherichia coli | 非甲羟戊酸途径（DOXP途径） | idi | 异戊烯基二磷酸异构酶 | 催化 | 非必需，表明IPP和DMAPP可独立产生。 |
关键发现
- lytB基因对大肠杆菌生存是必需的，缺失导致细胞裂解
- 在耗尽LytB后，生长约3小时正常，随后减慢，约4.6小时后发生裂解
- 添加10 mM的3-甲基-3-丁烯-1-醇(A2)或3-甲基-2-丁烯-1-醇(A3)可延迟裂解并支持有限生长，其中A2效果优于A3
- fkpB基因是非必需的，其缺失不影响正常生长（含有lytB的互补质粒时）
- 转导实验表明，只有提供lytB表达（pBAD-L加阿拉伯糖）才能获得223个Cmp抗性转导子，而不提供lytB时仅得到少数假阳性，证明lytB为必需基因
- 染色体单拷贝P_BAD控制的lytB菌株在无阿拉伯糖时不能在丰富或基本培养基上形成菌落
- 结构预测显示GcpE和LytB均为α/β球状蛋白，GcpE可能具有8条链的TIM桶结构。
研究结论
大肠杆菌lytB基因编码一种异戊二烯生物合成（非甲羟戊酸途径）所必需的产物，其缺失导致细胞裂解，表明该蛋白在类异戊二烯前体IPP/DMAPP生成中发挥关键作用；LytB和GcpE可能催化该途径最后步骤中的消除反应。