高级醇 · 代谢工程文献库

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Antisense RNA Downregulation of Coenzyme A Transferase Combined with Alcohol-Aldehyde Dehydrogenase Overexpression Leads to Predominantly Alcohologenic Clostridium acetobutylicum Fermentations

作者
Seshu B. Tummala, Stefan G. Junne, Eleftherios T. Papoutsakis
单位
Department of Chemical Engineering, Northwestern University, Evanston, Illinois 60208
杂志
Journal of Bacteriology（2003）
DOI
10.1128/JB.185.12.3644-3653.2003
所属领域
代谢工程
关键词
Alcohol-aldehyde dehydrogenaseAntisense RNAButanol/acetone ratioClostridium acetobutylicumCoenzyme A transferaseMetabolic engineering
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解决的核心问题

如何通过代谢工程提高Clostridium acetobutylicum丁醇/丙酮比例，同时避免因下调丙酮途径而导致的丁醇产量下降。

研究策略

构建重组质粒pAADB1，同时表达针对ctfB的反义RNA（ctfB1-asRNA）以抑制辅酶A转移酶（CoAT）合成，并过表达醇醛脱氢酶（aad）基因以恢复并增强丁醇/乙醇合成。

研究路线图

100%
研究问题：如何提高丁醇/丙酮比且不降丁醇产量
关键瓶颈：丙酮途径消耗碳源和还原力，CoAT为限速酶
策略：构建pAADB1质粒，反义RNA抑制ctfB+过表达aad基因
作用机制：ctfB1-asRNA靶向三顺反子mRNA，CoAT亚基下调>80%
关键改造：下调CoAT，增强丁醇/乙醇合成
发酵结果：丁醇恢复2.8倍，乙醇提高23倍达200mM，丁醇/丙酮比升至4.89
外源丁酸实验：乙醇降至144mM，丁醇不变（134mM），E/B比降至1.0
微阵列分析：273个差异表达基因（应激、芽孢、趋化）
结论：反义RNA+过表达组合重塑代谢，丁酸/丁酰辅酶A为限速因子，提供可调控代谢工程替代策略
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核心内容

该研究通过构建重组质粒pAADB1，在丙酮丁醇梭菌ATCC 824中同时实现了针对ctfB基因的反义RNA下调与醇醛脱氢酶（aad）基因的过表达，以重塑丙酮-丁醇发酵的代谢流向。与仅表达反义RNA的菌株相比，重组菌株的丁醇产量提高约2.8倍并恢复至质粒对照水平，乙醇滴度提高约23倍至约200 mM，为当时该菌中报道的最高值；丁醇/丙酮比从对照的1.83提高至4.89。向发酵液中添加丁酸可将乙醇产量降低约28%而不影响丁醇产量，表明丁酸/丁酰-CoA的可用性是限制丁醇合成的关键因素。DNA微阵列分析显示aad过表达引起273个基因差异表达，涉及应激反应、孢子形成和趋化性等。该研究首次将反义RNA与基因过表达技术结合于同一载体，提供了一种可调控、灵活的代谢工程策略，可有效提升目标溶剂产率并避免基因敲除带来的生长缺陷。

创新点

首次将反义RNA技术和基因过表达技术结合在同一载体上，同时实现丙酮途径下调与丁醇途径增强；获得了C. acetobutylicum中迄今报道的最高乙醇滴度；并利用DNA微阵列分析揭示aad过表达对转录组的全局影响。

研究对象（5）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Clostridium acetobutylicum ATCC 824 丙酮-丁醇发酵（溶剂生成途径） aad (adhE1) 醇醛脱氢酶 (AAD) 催化 在pAADB1中利用其天然启动子过表达，恢复丁醇合成并大幅提高乙醇产量
Clostridium acetobutylicum ATCC 824 丙酮生成途径 ctfA / ctfB 辅酶A转移酶 (CoAT) 催化 CoAT是丙酮生成途径的第一个酶；Western blot证实CtfA和CtfB亚基在多个生长阶段均显著下调
Clostridium acetobutylicum ATCC 824 丙酮生成途径 ctfB (反义RNA靶标) — 调控 质粒pCTFB1AS/pAADB1表达的ctfB1-asRNA与ctfB mRNA结合，导致aad-ctfA-ctfB三顺反子mRNA部分降解，从而下调CoAT和aad的表达
Clostridium acetobutylicum ATCC 824 丁醇/乙醇生成途径 adhE2 NADH依赖的醛/醇脱氢酶 催化 微阵列分析显示其在824(pAADB1)指数期表达较高，但在乙醇合成期表达较低，说明其并非乙醇形成的主要酶
Clostridium acetobutylicum ATCC 824 丁醇生成途径 bdhA / bdhB 丁醇脱氢酶 催化 表达模式受aad过表达影响，指数期在824(pAADB1)中较高，稳定期则相反

关键发现

  1. 与仅表达反义RNA的824(pCTFB1AS)相比，824(pAADB1)的丁醇产量提高约2.8倍并恢复到质粒对照水平
  2. 乙醇滴度提高约23倍，最高达约200 mM，为C. acetobutylicum中报道的最高值
  3. 丁醇/丙酮比从对照菌株824(pSOS95del)的1.83±0.05提高至824(pAADB1)的4.89±0.29
  4. CoAT亚基下调水平在多个生长阶段均超过80%
  5. 向824(pAADB1)发酵液中添加丁酸可降低乙醇形成约28%（至144 mM），而不降低丁醇产量（134 mM），乙醇/丁醇比从约1.5降至约1.0
  6. 微阵列分析发现273个差异表达基因，涉及应激反应、孢子形成和趋化性等。

研究结论

将反义RNA下调CoAT与aad过表达相结合，可有效重塑C. acetobutylicum的代谢，显著提高丁醇/丙酮比并创纪录地提高乙醇产量。丁酸/丁酰-CoA的可用性是限制丁醇形成的关键因素，而aad过表达会引发全局转录组变化。该方法为代谢工程提供了一种可调控、灵活的替代基因敲除的策略。