Cloning and Sequencing of the Gene Coding for Alcohol Dehydrogenase of Bacillus stearothermophilus and Rational Shift of the Optimum pH
- 作者
- Hisao Sakoda, Tadayuki Imanaka
- 单位
- Department of Biotechnology, Faculty of Engineering, Osaka University, Yamadaoka, Suita, Osaka 565, Japan
- 杂志
- Journal of Bacteriology（1992）
- DOI
- 10.1128/jb.174.4.1397-1402.1992
- 所属领域
- 酶工程
- 关键词
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解决的核心问题
克隆并测序嗜热脂肪芽孢杆菌的乙醇脱氢酶基因（adhT），通过定点突变验证其催化机制，并将酶的最适pH从中性（7.8）理性改造为碱性（9.0）
研究策略
以枯草芽孢杆菌为宿主、pTB524为载体克隆嗜热脂肪芽孢杆菌NCA1503的adhT基因并测序；将推导的氨基酸序列与不同来源ADH比对，依据马肝ADH三维结构推断催化系统；通过定点突变替换推测的催化残基（Cys-38、Thr-40、His-43）验证机制；将His-43突变为精氨酸以改变pKa，实现pH谱的碱性偏移
核心内容
该研究克隆并测序了嗜热脂肪芽孢杆菌NCA1503的乙醇脱氢酶基因adhT，全长为1011 bp，编码337个氨基酸，推算分子量为36,098。以枯草芽孢杆菌为宿主、pTB524为载体实现异源表达，重组菌株的ADH活性达1.48 U/mg细胞干重，比DNA供体菌株高约9倍。通过序列比对发现ADH-T与酿酒酵母ADH II的氨基酸一致性为45%，与马肝、人、玉米来源ADH约35%。依据马肝ADH三维结构推断催化系统，经定点突变验证Cys-38、Thr-40和His-43为催化关键残基，其中Cys-38-Ser、Thr-40-Ala、His-43-Ala突变均使酶活性丧失，而Thr-40-Ser保留部分活性。将His-43突变为精氨酸后，酶的最适pH从中性7.8移至碱性9.0，且最大活性约为野生型的2倍。该工作首次克隆了该嗜热菌的ADH基因，并通过理性设计催化残基有效调节了酶的反应pH特性，为酶工程改造提供了可行策略。
创新点
首次克隆并测定了B. stearothermophilus NCA1503的ADH-T基因；基于马肝ADH三维结构推断ADH-T的质子释放系统；通过定点突变将His-43替换为精氨酸，使最适pH从7.8移至9.0，且最大活性提高约2倍
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Bacillus subtilis M1113/M1112 | 乙醇代谢 | adhT | ADH-T | 催化 | 宿主细胞用于克隆和表达来自B. stearothermophilus的乙醇脱氢酶基因 |
| Bacillus stearothermophilus NCA1503 | 乙醇代谢 | adhT | ADH-T | 催化 | 野生型adhT基因的供体菌 |
| Bacillus subtilis M1113 | 乙醇代谢 | adhT突变体（Thr-40-Ser） | Thr-40-Ser ADH-T | 催化 | 通过定点突变将Thr-40替换为Ser，保留部分催化活性 |
| Bacillus subtilis M1113 | 乙醇代谢 | adhT突变体（His-43-Arg） | His-43-Arg ADH-T | 催化 | 将His-43替换为Arg，最适pH移至9.0，活性约为野生型2倍 |
| Escherichia coli TG1 | — | — | — | 催化 | 用于M13噬菌体介导的核苷酸测序的宿主细胞 |
关键发现
- adhT基因全长1011 bp，编码337个氨基酸，推算分子量为36,098；重组质粒载体菌株ADH活性为1.48 U/mg（细胞干重），比DNA供体（0.17 U/mg）高约9倍，宿主活性<0.002 U/mg；ADH-T与酿酒酵母ADH II氨基酸序列一致性为45%，与玉米、人、马肝ADH约35%；定点突变Cys-38-Ser、Thr-40-Ala、His-43-Ala均丧失活性，Thr-40-Ser保留活性但略低；His-43-Arg突变体在pH
- 0时最大活性约为野生型（pH
- 8）的2倍
研究结论
成功克隆并测序了adhT基因；通过定点突变证实Cys-38、Thr-40和His-43为ADH-T催化活性关键残基，其中Thr-40的羟基和His-43的咪唑环参与质子释放系统；将His-43替换为碱性更强的精氨酸（His-43-Arg）可显著提高最适pH和催化活性，表明通过理性改造催化残基可调节酶的反应pH特性