Mechanism of Bacitracin Resistance in Gram-Negative Bacteria That Synthesize Exopolysaccharides
- 作者
- THOMAS J. POLLOCK, LINDA THORNE, MOTOHIDE YAMAZAKI, MARCIA J. MIKOLAJCZAK, RICHARD W. ARMENTROUT
- 单位
- Shin-Etsu Bio, Inc., San Diego, California 92121
- 杂志
- Journal of Bacteriology（1994）
- DOI
- 10.1128/jb.176.20.6229-6237.1994
- 所属领域
- 微生物学
- 关键词
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解决的核心问题
阐明合成胞外多糖的革兰氏阴性细菌对杆菌肽产生抗性的机制，特别是胞外多糖合成与异戊二烯脂载体（C55-isoprenyl phosphate）利用之间的关联。
研究策略
通过自发突变和转座子插入筛选杆菌肽抗性（Bacr）突变体，分析其胞外多糖合成表型；利用基因互补实验鉴定和验证gumD、spsB等基因的功能；通过种属间互作互补、多糖水解产物色谱分析以及生长曲线测定来验证抗性机制。
核心内容
该研究通过遗传学和生化手段，揭示了合成胞外多糖的革兰氏阴性菌对杆菌肽产生抗性的机制。研究者利用自发突变和转座子插入筛选获得杆菌肽抗性突变体，发现野生动型黄单胞菌在含20微克每毫升杆菌肽下生长受限，而gumD突变体可在100微克每毫升下存活，且导入gumD基因后恢复敏感。约四分之三的Bacr突变体同时丧失黄原胶合成能力，表明菌株通过阻断多糖合成来释放被杆菌肽螯合的异戊二烯脂载体，从而保障必需细胞壁合成。基因互补实验证实，黄单胞菌gumD与鞘氨醇单胞菌spsB编码的糖基-IP转移酶可跨属功能互补，薄层色谱显示互补株产多糖成分与受体菌一致，证明葡萄糖-磷酸与脂载体结合是两类多糖合成的共同起始步骤。该机制为理解胞外多糖合成与抗生素抗性间的代谢权衡提供了遗传工具和理论依据。
创新点
首次揭示杆菌肽抗性可通过停止胞外多糖合成来实现，使有限的异戊二烯脂载体更多用于必需的细胞壁合成；发现X. campestris的gumD基因与Sphingomonas的spsB基因可跨属互补，证明葡萄糖-磷酸与异戊二烯脂载体结合是黄原胶和sphingan合成的共同起始步骤；遗传和生化证据表明sphingan组装为分支结构，区别于黄原胶和colanic acid的线性亚基组装。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Xanthomonas campestris X59 | 黄原胶合成 | gumD | GumD | 催化 | 催化葡萄糖-磷酸从UDP-Glc转移到C55-异戊二烯磷酸（IP），形成Glc-PPI，是黄原胶组装的第一步；gumD突变导致杆菌肽抗性（Bacr）和黄原胶缺失（Gum-）。 |
| Sphingomonas strain S-88 | sphingan S-88合成 | spsB | SpsB | 催化 | 新克隆的基因，属于糖基-IP转移酶家族，可互补X. campestris的gumD突变，推测其催化葡萄糖-磷酸与IP的结合，起始sphingan S-88合成。 |
| Sphingomonas strain NW11 | sphingan NW11合成 | spsB（同源） | SpsB（同源） | 催化 | NW11的Bacr Sps-突变体（bac3-1、bac3-3）可被S-88的spsB基因恢复多糖合成，表明两者共享起始糖基转移酶。 |
| Escherichia coli K-12 | colanic acid合成 | cpsABCDE cluster | — | 催化 | Bacr Cps-突变（TP416-419、TP429-431）定位到cps基因簇附近，推测其中包含负责葡萄糖-磷酸与IP结合的转移酶基因，但无法被gumD或spsB互补。 |
| Escherichia coli K-12 | 细胞壁/异戊二烯脂代谢 | bacA | BacA | 催化 | 文献引用：bacA基因编码脂激酶，通过磷酸化异戊二烯醇增加IP水平，赋予杆菌肽抗性，是另一条不涉及胞外多糖缺失的抗性机制。 |
关键发现
- ['野生型X. campestris X59在含20 μg/ml杆菌肽的YM培养基中生长很差，而gumD突变体（如s1B）可在100 μg/ml杆菌肽下生长
- 当导入gumD基因质粒pRK311c8后，突变体恢复对杆菌肽的敏感性（细胞产量降至野生型水平）。', 'X. campestris自发杆菌肽抗性突变频率约为10^-5，其中约四分之三的Bacr突变体同时失去黄原胶合成能力（Gum-）。', '对15个Bacr Gum-突变体进行互补分析，10个（s1B、s1C、s2A、s2C、s3A、s3C、s4A、s4C、s5A、s5C）被含gumD的质粒pSEB19、pRK311-1483和pRK311c8恢复为产黏液（Gum+）。', 'Sphingomonas S-88在含500-800 μg/ml杆菌肽的YM平板上，从约6×10^7细胞中筛选到56个Bacr突变体，其中50个不产生S-88多糖（Sps-）。', 'E. coli TP11（Lon- Cps+）在含4-5 mg/ml杆菌肽的M9CGM平板上，Bacr突变频率为每10^6细胞1-10个，其中约25-60%为非黏液型（Cps-）
- TP416（Bacr Cps-）在杆菌肽4 mg/ml下培养后A600约为0.7，而亲本TP11在2 mg/ml时A600降至0.4（30°C）。', 'X. campestris的gumD基因能恢复Sphingomonas S-88和NW11的多糖合成
- S-88中克隆的spsB基因（位于pRK311-S88c1上约2 kb区域）也能恢复X. campestris gumD突变体（m31、m65、m96）的黄原胶合成。', '薄层色谱分析证实，X. campestris接受S-88基因后产生含葡萄糖、甘露糖、葡萄糖醛酸的多糖（与黄原胶一致）
- S-88接受gumD基因后产生含鼠李糖、甘露糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸的多糖（与S-88一致）。', '将gumD或spsB基因导入E. coli的Bacr Cps-突变体（TP416-419）不能恢复其多糖合成或杆菌肽敏感性，说明跨属互补不能延伸至E. coli。']
研究结论
在合成胞外多糖的革兰氏阴性菌（Xanthomonas campestris、Sphingomonas strains、Escherichia coli）中，杆菌肽抗性常通过阻断胞外多糖合成来实现，以避免异戊二烯脂载体（IP）被杆菌肽-IPP复合物螯合，从而保障细胞壁合成。gumD和spsB编码的糖基-IP转移酶是黄原胶和sphingan合成的共同起始酶，且可跨属功能互补，但E. coli的相关酶不能被它们替代。该机制为研究胞外多糖合成、杆菌肽抗性以及多糖组装途径提供了新的遗传工具和理论依据。