Cloning and High-Level Expression of the Glutathione-Independent Formaldehyde Dehydrogenase Gene from Pseudomonas putida
- 作者
- KIYOSHI ITO, MARI TAKAHASHI, TADASHI YOSHIMOTO, DAISUKE TSURU
- 单位
- School of Pharmaceutical Sciences, Nagasaki University
- 杂志
- Journal of Bacteriology（1994）
- DOI
- 10.1128/jb.176.9.2483-2491.1994
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
克隆并表达恶臭假单胞菌的不依赖谷胱甘肽的甲醛脱氢酶基因，并解析其结构特征与酶学性质。
研究策略
基于纯化蛋白的N端和CNBr肽段序列设计PCR引物，扩增基因片段作为探针，从P. putida染色体DNA中克隆fdhA基因，在大肠杆菌中表达，并测定酶学性质及进行序列比对。
核心内容
该研究从恶臭假单胞菌中克隆了不依赖谷胱甘肽的甲醛脱氢酶基因fdhA，并在大肠杆菌中实现高水平表达。研究者根据纯化蛋白的N端及CNBr肽段序列设计PCR引物扩增基因片段，进而从染色体DNA中克隆全长基因。fdhA含1,197 bp开放阅读框，编码399个氨基酸，计算分子量42,082 Da。将携带该基因的质粒pFDHK3DN71导入大肠杆菌DH5α后，甲醛脱氢酶活性比原菌高约50倍，重组蛋白占细胞总蛋白近30%，纯化后比活达24.1 U/mg，总回收率45%。酶学分析显示最适pH为8.9，对甲醛的Km为0.30 mM，对4-甲基吡唑的Ki为0.03 mM，酶为四聚体（分子量150 kDa），等电点5.0。序列比对表明该酶属于含锌中链ADH家族，与已知成员同源性为14%~20%，含有保守的辅酶结合基序及锌配位残基，兼具哺乳动物I类和III类ADH的特征。这一高效表达系统为深入研究该酶的锌配位机制和不依赖谷胱甘肽的甲醛脱氢催化机理奠定了重要基础。
创新点
首次报道不依赖谷胱甘肽的甲醛脱氢酶基因序列；在大肠杆菌中实现约50倍于原菌的高水平表达。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli DH5α | 甲醛氧化代谢 | fdhA | 甲醛脱氢酶（FDH） | 催化 | 重组表达宿主，携带质粒pFDHK3DN71，表达量约为P. putida的50倍 |
| Pseudomonas putida C-83 | 甲醛氧化代谢 | fdhA | 甲醛脱氢酶（FDH） | 催化 | 基因来源菌株，该酶催化甲醛不可逆氧化为甲酸，不依赖谷胱甘肽 |
关键发现
- fdhA基因含有1,197 bp开放阅读框，编码399个氨基酸，计算分子量为42,082 Da。含pFDHK3DN71质粒的大肠杆菌DH5α甲醛脱氢酶活性比P. putida高约50倍，FDH蛋白占细胞总蛋白近30%。纯化后比活为24.1 U/mg，总回收率45%。重组酶最适pH
- 9，对甲醛Km为0.30 mM（天然酶0.25 mM），对4-甲基吡唑Ki为0.03 mM。酶为四聚体，分子量150 kDa，pI
- 0。序列与含锌中链ADH家族同源性为14%~20%，含有保守的辅酶结合域Gly-Xaa-Gly-Xaa-Xaa-Gly基序及催化/结构锌配位残基。
研究结论
P. putida的不依赖谷胱甘肽的甲醛脱氢酶属于含锌中链ADH家族，同时具有哺乳动物I类和III类ADH的混合特性。克隆的基因和高效表达系统为研究其锌配位及不依赖谷胱甘肽的甲醛脱氢机理提供了基础。