Menaquinone (Vitamin K2) Biosynthesis: Overexpression, Purification, and Characterization of a New Isochorismate Synthase from Escherichia coli
- 作者
- R. Daruwala, Dipak K. Bhattacharyya, O. Kwon, R. Meganathan
- 单位
- Department of Biological Sciences, Northern Illinois University, DeKalb, Illinois 60115
- 杂志
- Journal of Bacteriology（1997）
- DOI
- 10.1128/jb.179.10.3133-3138.1997
- 所属领域
- 代谢工程与酶学
- 关键词
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解决的核心问题
甲萘醌（维生素K2）生物合成途径中第一个关键酶异分支酸合成酶（MenF）的过表达、纯化与性质表征，并证明其与肠杆菌素生物合成中的EntC异分支酸合成酶不同。
研究策略
利用T7启动子在大肠杆菌BL21(DE3)中过表达menF基因，通过硫酸鱼精蛋白沉淀、DEAE-阴离子交换层析和活性黄86-琼脂糖亲和层析纯化至均一，并系统表征其酶学性质。
核心内容
该研究在大肠杆菌BL21(DE3)中利用T7启动子过表达了甲萘醌生物合成途径的首个关键酶—异分支酸合成酶MenF，并通过硫酸鱼精蛋白沉淀、DEAE阴离子交换层析和活性黄86亲和层析将其纯化至均一。酶学表征显示MenF为同源二聚体，天然分子量约98 kDa，亚基为48 kDa；最适pH 7.5–8.0，最适温度37℃，催化反应不可逆且绝对依赖Mg²⁺（最适1 mM）。其Km为195±23 μM，kcat为80 min⁻¹，加入30 mM β-巯基乙醇后kcat提升至176 min⁻¹，表明半胱氨酸残基对活性至关重要；N-乙基马来酰亚胺可完全失活酶，而底物分支酸能提供保护。纯化后比活力达808 nmol·min⁻¹·mg⁻¹，较粗提物提高18倍，过表达菌株活性较野生型提高约4500倍。该结果证实MenF是甲萘醌合成中特异性的异分支酸合成酶，尽管与肠杆菌素途径的EntC催化相同反应，但在寡聚状态、反应可逆性及动力学参数上显著不同，为维生素K2的微生物发酵生产提供了酶学基础。
创新点
首次纯化并表征了由menF基因编码的新型异分支酸合成酶MenF，证明其为同源二聚体，催化不可逆反应，且半胱氨酸残基对活性至关重要。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | 甲萘醌（维生素K2）生物合成 | menF | MenF | 催化 | 异分支酸合成酶，催化分支酸转化为异分支酸，是甲萘醌生物合成的第一个关键步骤；过表达于T7启动子下。 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 肠杆菌素生物合成 | entC | EntC | 催化 | 异分支酸合成酶，与MenF功能相似但可逆；作为对照用于研究MenF的反应可逆性。 |
关键发现
- 纯化的MenF天然分子量为98 kDa（凝胶过滤），SDS-PAGE显示亚基分子量为48 kDa，因此为同源二聚体
- 最适pH为7.5-8.0，最适温度为37℃
- Km为195±23 μM，kcat为80 min⁻¹，加入30 mM β-巯基乙醇后kcat升至176 min⁻¹
- 粗提物比活力为45 nmol·min⁻¹·mg⁻¹，纯化18倍后比活力为808 nmol·min⁻¹·mg⁻¹，回收率28%
- 过表达菌株活性比野生型提高约4500倍
- 酶活性绝对依赖Mg²⁺，最适浓度为1 mM，Mn²⁺、Co²⁺活性远低于Mg²⁺
- N-乙基马来酰亚胺（NEM）可完全失活酶，底物分支酸可保护酶免受NEM抑制
- 反应不可逆。
研究结论
MenF是甲萘醌生物合成中特异性的异分支酸合成酶，与EntC催化相同反应但性质不同（二聚体、不可逆、Km更高），且半胱氨酸残基位于底物结合位点附近，对催化活性至关重要。