高级醇 · 代谢工程文献库

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Purification and Biochemical Characterization of a Hydroxyneurosoprene Desaturase Involved in the Biosynthetic Pathway of the Carotenoid Spheroidene in Rhodobacter sphaeroides

作者
MANUELA ALBRECHT, ANDREA RUTHER, GERHARD SANDMANN
单位
Biosynthesis Group, Botanical Institute, J. W. Goethe Universität, D-60054 Frankfurt, Germany
杂志
Journal of Bacteriology（1997）
DOI
10.1128/jb.179.23.7462-7467.1997
所属领域
代谢工程
关键词
C-3,4 desaturationRhodobacter sphaeroidescarotenoid biosynthesisenzyme purificationhydroxyneurosporene desaturasespheroidene
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解决的核心问题

确定Rhodobacter sphaeroides中参与类胡萝卜素球烯生物合成途径的羟神经孢子烯脱饱和酶（HND）的生化特性及其在途径中的精确反应顺序

研究策略

将R. sphaeroides的crtD基因在大肠杆菌中高效表达，利用N端六组氨酸标签通过Ni-NTA亲和层析一步纯化至均一，通过体外酶活测定研究辅因子需求、底物特异性和动力学参数，并结合不同类胡萝卜素底物的转化分析确定反应顺序

研究路线图

100%
研究问题：确定HND脱饱和酶的生化特性与反应顺序
策略：大肠杆菌异源表达+Ni-NTA亲和纯化
纯化表征：表观59kDa，纯化285倍，比活20.09μg/mg·h
辅因子需求：分子氧为氢受体，非NAD+/NADP+/FAD
底物特异性：Km=13.4μM，偏好1-羟基神经孢子烯
反应顺序：先C-3,4脱饱和后甲基化，不作用于甲氧基底物
结果：HND催化1-羟基神经孢子烯生成去甲基球烯
结论：揭示球烯生物合成途径的精确反应顺序
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核心内容

该研究在大肠杆菌中高效表达了光合细菌Rhodobacter sphaeroides的crtD基因，通过N端六组氨酸标签和Ni-NTA亲和层析一步纯化获得均一的羟神经孢子烯脱饱和酶（HND），并对其生化特性进行了系统表征。纯化后的酶在SDS-PAGE上表观分子量为59 kDa，纯化倍数达285倍，比活为20.09 μg DMS/mg·h。酶学分析证明HND以分子氧作为氢受体，厌氧条件下活性保留不足10%，且NAD+、NADP+或FAD均不能替代氧恢复活性；该酶对1-羟基神经孢子烯的Km为13.4 μM，对1-羟基神经孢子烯和1-羟基环戊烯活性最高，但不能转化1-甲氧基神经孢子烯。这一底物特异性明确排除了先甲基化后脱饱和的替代途径，证明球烯生物合成中C-3,4脱饱和严格先于甲基化。该工作首次纯化并表征了羟神经孢子烯脱饱和酶，并揭示其与蓝藻ζ-胡萝卜素脱饱和酶在生化和系统发育上的相关性，为理解类胡萝卜素途径的进化关系提供了依据。

创新点

首次纯化并表征羟神经孢子烯脱饱和酶；证明其以分子氧作为氢受体，而非NAD+、NADP+或FAD；阐明球烯生物合成途径中先进行C-3,4脱饱和、后甲基化的唯一顺序；发现该酶与蓝藻ζ-胡萝卜素脱饱和酶在生化和系统发育上的相关性

研究对象（3）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Escherichia coli 类胡萝卜素生物合成途径 crtD hydroxyneurosoprene desaturase (HND) 催化 来自Rhodobacter sphaeroides，在大肠杆菌中异源表达并纯化，催化1-羟基神经孢子烯C-3,4位脱饱和
Escherichia coli 类胡萝卜素生物合成途径 crtC neurosporene hydratase 催化 用于合成底物1-羟基神经孢子烯等1-羟基类胡萝卜素
Escherichia coli 类胡萝卜素生物合成途径 crtF hydroxyneurosporene methylase 催化 用于合成底物1-甲氧基神经孢子烯，验证HND是否催化其脱饱和

关键发现

  1. 纯化的HND在SDS-PAGE上表观分子量为59 kDa（与推算的58 kDa一致），表达量占大肠杆菌总蛋白的6.6%
  2. 经Nonidet P-40增溶和Ni-NTA亲和纯化后，纯化倍数为285倍，比活达20.09 μg DMS/mg·h
  3. 以分子氧为氢受体，厌氧条件下活性保留不足10%，加入NAD+、NADP+或FAD均不能恢复活性
  4. 对1-羟基神经孢子烯的Km为13.4 μM
  5. 1-羟基神经孢子烯和1-羟基环戊烯是良好底物，1-羟基-γ-胡萝卜素和1,1'-二羟基番茄红素转化效率较低，1'-羟基-3,4-二脱氢环戊烯仅有痕量产物，而1-甲氧基神经孢子烯完全不被转化
  6. HND不被100 μM二苯胺抑制

研究结论

羟神经孢子烯脱饱和酶在Rhodobacter sphaeroides中催化1-羟基神经孢子烯的C-3,4脱饱和反应生成脱甲基球烯，随后经甲基化生成球烯；该酶不作用于1-甲氧基神经孢子烯，因此球烯生物合成途径中甲基化发生在脱饱和之后，排除了先甲基化后脱饱和的替代途径