Biosynthesis of Plant Isoprenoids: Perspectives for Microbial Engineering
- 作者
- James Kirby, Jay D. Keasling
- 单位
- California Institute of Quantitative Biomedical Research, University of California, Berkeley, California 94720; Departments of Chemical Engineering and Bioengineering, University of California, Berkeley, California 94720; Physical Biosciences Division, Lawrence Berkeley National Laboratory, Berkeley, California 94720; Joint BioEnergy Institute, Emeryville, California 94608
- 杂志
- Annual Review of Plant Biology（2009）
- DOI
- 10.1146/annurev.arplant.043008.091955
- 所属领域
- 代谢工程 / 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
植物类异戊二烯生物合成途径复杂，相关基因发现困难，且植物P450酶等修饰酶在微生物宿主中难以功能表达，阻碍了利用微生物高效生产高价值异戊二烯化合物。
研究策略
综述植物异戊二烯生物合成的功能、基因发现工具及途径工程进展；系统分析MVA和DXP途径工程、P450表达与突变、组合工程和全局优化等策略在植物和微生物中的应用。
核心内容
该综述系统梳理了植物类异戊二烯生物合成途径的基因发现工具与代谢工程策略，重点分析了MVA和DXP途径工程、P450酶功能表达以及组合优化方法在微生物宿主中的应用。作者提出将植物途径的区室化知识移植到工程设计中，例如在烟草叶绿体中同时表达紫穗槐二烯合酶和FPP合酶，使amorphadiene产量超过25 μg/g鲜重，较细胞质表达提高25,000倍；而在地杆菌中引入甲羟戊酸途径并共表达关键酶后，两相生物反应器中amorphadiene产量达400 mg/L，经长期工程迭代最终超过480 mg/L。针对P450酶难以在微生物中表达的问题，综述总结了N端修饰、P450-CPR融合以及细菌P450改造等策略，实现在大肠杆菌中将amorphadiene转化为青蒿素前体青蒿酸产量超300 mg/L。此外，通过水稻胚乳工程使类胡萝卜素含量从1.6 μg/g经引入玉米八氢番茄红素合酶后提高23倍至37 μg/g，显示组合启动子替换、转录工程和生物传感器筛选等全局优化手段的潜力。这些结果表明微生物宿主在植物异戊二烯高价值产物生产中已具备实际竞争力，而进一步提升P450功能表达与筛选效率是突破当前瓶颈的关键方向。
创新点
['将植物异戊二烯途径区室化知识用于代谢工程（如把倍半萜合成转入叶绿体以重定向通量）', '采用组合启动子替换、转录工程（gTME）、生物传感器筛选等全局优化方法', '通过N端修饰、P450-CPR融合、细菌P450改造等提升P450功能表达']
研究对象（16）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | 甲羟戊酸途径 | idi | isopentenyl diphosphate isomerase | 催化 | IPP与DMAPP异构化，对植物比细菌更重要 |
| Escherichia coli | DXP途径 | dxs | 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase | 催化 | DXP途径第一步，限速酶，过表达可提高产量 |
| Escherichia coli | 甲羟戊酸途径 | ADS | amorphadiene synthase | 催化 | 倍半萜合酶，合成青蒿素前体amorphadiene |
| Escherichia coli | 青蒿素前体合成 | CYP71AV1 | cytochrome P450 monooxygenase CYP71AV1 | 催化 | 催化amorphadiene氧化为artemisinic acid，需CPR |
| Saccharomyces cerevisiae | 甲羟戊酸途径 | HMGR | 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase | 催化 | 截短形式去除降解调控域，增强通量 |
| Saccharomyces cerevisiae | 甲羟戊酸途径 | ERG9 | squalene synthase | 催化 | 下调以减少FPP流向甾醇分支 |
| Saccharomyces cerevisiae | 甲羟戊酸途径 | UPC2-1 | mutant transcription factor UPC2 | 调控 | 突变转录因子，同时上调多个MVA途径基因 |
| Saccharomyces cerevisiae | 青蒿素前体合成 | CYP71AV1 | cytochrome P450 monooxygenase CYP71AV1 | 催化 | 在酵母中功能表达，artemisinic acid产量>100 mg/L |
| Nicotiana tabacum | 质体类异戊二烯途径 | FPP synthase | farnesyl diphosphate synthase | 催化 | 在叶绿体表达，将DXP途径通量导向FPP |
| Nicotiana tabacum | 质体类异戊二烯途径 | ADS | amorphadiene synthase | 催化 | 靶向叶绿体表达，amorphadiene产量达25 μg/g鲜重 |
| Mentha × piperita | 单萜生物合成 | pulegone reductase | (+)-pulegone reductase | 催化 | 受副产物(+)-menthofuran抑制，Ki=300 μM |
| Mentha × piperita | 单萜生物合成 | menthofuran synthase | menthofuran synthase | 催化 | 生产反馈抑制物menthofuran，其反义表达提高薄荷醇纯度 |
| Oryza sativa | 类胡萝卜素生物合成 | PSY | phytoene synthase | 催化 | 来自玉米，使金大米类胡萝卜素提高23倍至37 μg/g |
| Solanum tuberosum | 类胡萝卜素生物合成 | Or | Orange protein | 调控 | 促进色质体分化，块茎类胡萝卜素提高6倍 |
| Escherichia coli | 萜烯氧化 | P450cam | cytochrome P450cam | 催化 | 来自Pseudomonas putida，经突变可氧化(+)-α-蒎烯 |
| Escherichia coli | 脂肪酸羟基化 | P450 BM-3 | cytochrome P450 BM-3 | 催化 | 来自Bacillus megaterium，天然融合P450-还原酶，可工程化用于异戊二烯底物 |
关键发现
- ['在本塞姆氏烟草中沉默IPP异构酶（IDI）导致类胡萝卜素和叶绿素等色素含量降低80%。', '通过工程化水稻胚乳，类胡萝卜素含量最初达到1.6 μg/g
- 引入玉米phytoene synthase后提高23倍，达37 μg/g。', '在马铃薯中表达Or基因使块茎类胡萝卜素水平提高6倍，phytoene从0增加至约10 μg/g。', '薄荷中的(+)-pulegone还原酶被副产物(+)-menthofuran抑制，Ki=300 μM
- 低光条件下分泌细胞中menthofuran浓度达20 mM。', '在烟草叶绿体中同时表达ADS和FPP合酶，amorphadiene产量超过25 μg/g鲜重，较细胞质表达提高25,000倍。', '在E. coli中引入甲羟戊酸途径并共表达ADS，amorphadiene产量在两相生物反应器中达400 mg/L，经十年工程最终超过480 mg/L
- 在S. cerevisiae中达150 mg/L。', 'E. coli中功能表达CYP71AV1将amorphadiene转化为artemisinic acid，产量超过300 mg/L
- 酵母中超过100 mg/L。']
研究结论
微生物宿主在植物异戊二烯生产中显示出巨大潜力，通过途径工程和P450表达优化已实现高产量；进一步开发P450功能表达与组合筛选将是突破瓶颈的关键。