Purification and Immobilization of the Recombinant Brassica oleracea Chlorophyllase 1 (BoCLH1) on DIAION®CR11 as Potential Biocatalyst for the Production of Chlorophyllide and Phytol
- 作者
- Yi-Li Chou, Chia-Yun Ko, Long-Fang O. Chen, Chih-Chung Yen, Jei-Fu Shaw
- 单位
- Institute of Biotechnology, National Cheng Kung University; Institute of Plant and Microbial Biology, Academia Sinica; Department of Biological Science and Technology, I-Shou University; Agricultural Biotechnology Center, National Chung Hsing University
- 杂志
- Molecules（2015）
- DOI
- 10.3390/molecules20033744
- 所属领域
- 酶工程
- 关键词
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解决的核心问题
游离叶绿素酶稳定性差、难以回收重复利用，导致工业生产成本高；需要开发一种低成本、可重复使用的固定化生物催化剂来生产叶绿素酸酯和植醇。
研究策略
利用DIAION®CR11金属螯合树脂通过Cu(II)离子亲和吸附，从粗细胞裂解液中一步实现重组多聚组氨酸标签BoCLH1的纯化与固定化，并系统研究固定化酶的生化特性、热稳定性和操作稳定性。
核心内容
该研究利用DIAION®CR11金属螯合树脂通过Cu(II)离子亲和吸附，从大肠杆菌粗细胞裂解液中一步实现了重组多聚组氨酸标签BoCLH1叶绿素酶的纯化与固定化。Cu(II)显示出最高的蛋白吸附量，固定化吸附容量为9.2 ± 0.43 mg/g gel，酶活达46.3 ± 3.14 U/g gel，固定化产率为74.3%。固定化酶最适pH为8.0，最适温度40 °C，在弱碱环境下活性更高。热稳定性显著提升，60 °C下半衰期从游离酶的25.42分钟提高至54.35分钟，70 °C时相对活性为49.62%，而游离酶仅27.63%。固定化酶可重复使用17次仍保持约60%残余活性，且通过再负载粗酶液可恢复至95%以上活性，显著降低了工业应用成本。该研究首次将DIAION®CR11用于BoCLH1固定化，所制备的生物催化剂兼具高稳定性和可重复使用性，为叶绿素酸酯和植醇的工业化生产提供了经济可行的酶催化方案。
创新点
首次将DIAION®CR11用于BoCLH1的固定化，Cu(II)显示出最高的蛋白吸附量和酶活；固定化酶在弱碱环境下活性更高，60 °C下半衰期提高约两倍，且可重复使用17次并可通过再负载恢复活性。
研究对象（1）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | 叶绿素降解通路（叶绿素水解为叶绿素酸酯和植醇） | BoCLH1 (GenBank: AF337544) | BoCLH1（叶绿素酶1，chlorophyllase 1） | 催化 | 重组BoCLH1带有C端His标签，分子量38.63 kDa，在E. coli中表达，通过DIAION®CR11-Cu(II)亲和吸附实现纯化和固定化 |
关键发现
- 重组BoCLH1分子量为38.63 kDa；Cu(II)固定化吸附容量为9.2 ±
- 43 mg/g gel，酶活为46.3 ±
- 14 U/g gel，固定化产率为74.3% ±
- 49%；固定化酶最适pH
- 0，最适温度40 °C；70 °C时固定化酶相对活性49.62%，游离酶仅27.63%；60 °C下半衰期从游离酶的25.42 min提高到54.35 min（约2倍）；重复使用17次后残余活性约60%，第18次后降至32%；再负载粗酶液（含或不含Cu²⁺）后残余活性可恢复到95%以上。
研究结论
DIAION®CR11Cu(II)固定的重组BoCLH1是一种成功的固定化酶，具备高稳定性、可重复使用性和低工业应用成本，有望用于叶绿素酸酯和植醇的工业化生产。