Insights into CO₂ Fixation Pathway of Clostridium autoethanogenum by Targeted Mutagenesis
- 作者
- Fungmin Liew, Anne M. Henstra, Klaus Winzer, Michael Köpke, Sean D. Simpson, Nigel P. Minton
- 单位
- BBSRC/EPSRC Synthetic Biology Research Centre (SBRC), School of Life Sciences, University Park, The University of Nottingham, Nottingham, United Kingdom; LanzaTech Inc., Skokie, Illinois, USA
- 杂志
- mBio（2016）
- DOI
- 10.1128/mBio.00427-16
- 所属领域
- 代谢工程 / 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
在自养菌Clostridium autoethanogenum中，三种一氧化碳脱氢酶（CODH）同工酶（acsA、cooS1、cooS2）在Wood-Ljungdahl通路中的体内功能尚未被实验证实，且acsA基因中存在独特的内部TGA终止密码子，其翻译机制未知。
研究策略
利用ClosTron基因敲除技术分别失活三种CODH编码基因（acsA、cooS1、cooS2），构建基因敲除菌株，并比较其在CO、H₂/CO₂及果糖等不同底物下的生长和代谢产物谱；通过FLAG标签和Western blot分析acsA的翻译通读机制，并用互补实验验证基因功能。
核心内容
该研究利用ClosTron基因敲除技术分别失活自养菌Clostridium autoethanogenum中三种一氧化碳脱氢酶编码基因acsA、cooS1和cooS2，系统探究了它们在Wood-Ljungdahl通路中的体内功能。结果显示acsA是自养生长必需的CODH/ACS复合体组分，其敲除菌株在CO条件下培养48天无生长，在果糖异养生长中乙酸产量从野生型的86.0 mM骤降至仅2.6 mM，碳流显著转向乙醇、2,3-丁二醇和乳酸，产量分别增加113%、138%和125%。cooS1和cooS2对自养生长非必需且存在功能冗余，但敲除cooS1在H₂/CO₂条件下生长优于野生型，OD600翻倍，提示其可作为提高气体利用效率的代谢工程靶点。研究还发现acsA基因内部存在菌种特异性的TGA终止密码子，通过低频率翻译通读产生全长69 kDa蛋白，该机制在E. coli中不成立。该工作首次从实验上证实了acsA的核心地位，为理解Wood-Ljungdahl通路的碳固定机制和优化自养微生物气体发酵提供了重要依据。
创新点
['首次在体内通过靶向突变证实acsA是C. autoethanogenum自养生长必需的CODH/ACS复合体组分', '发现cooS1和cooS2对自养生长非必需，存在功能冗余', '发现敲除cooS1在H₂/CO₂条件下生长优于野生型（OD600翻倍），提示可作为代谢工程策略', '发现acsA内部TGA终止密码子介导翻译通读，且该通读具有菌种特异性', '证明acsA敲除在异养生长中完全消除乙酸生成，将碳流转向乙醇、乳酸和2,3-丁二醇']
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Clostridium autoethanogenum DSM 10061 | Wood-Ljungdahl通路 | acsA (CAETHG_1620-1621) | CODH/ACS复合体的CODH组分 | 催化 | 催化CO与CO₂可逆氧化还原及乙酰辅酶A合成；内部含TGA终止密码子 |
| Clostridium autoethanogenum DSM 10061 | Wood-Ljungdahl通路 | cooS1 (CAETHG_3005) | 一氧化碳脱氢酶CODH | 催化 | 单功能CODH；失活后H₂/CO₂条件下生长增强，CO条件下生长受损 |
| Clostridium autoethanogenum DSM 10061 | Wood-Ljungdahl通路 | cooS2 (CAETHG_3899) | 一氧化碳脱氢酶CODH | 催化 | 单功能孤儿CODH；对自养生长影响不显著 |
| Clostridium autoethanogenum DSM 10061 | 糖酵解/乙酸生成途径 | pta | 磷酸转乙酰酶 | 催化 | 乙酰CoA转化为乙酰磷酸，未被敲除但acsA失活后乙酸生成被消除 |
| Clostridium autoethanogenum DSM 10061 | 糖酵解/乙酸生成途径 | ack | 乙酸激酶 | 催化 | 乙酰磷酸生成乙酸，未被敲除但acsA失活后乙酸生成被消除 |
| Clostridium autoethanogenum DSM 10061 | 乙醇代谢 | 未指定（醛铁氧还蛋白氧化还原酶） | 醛铁氧还蛋白氧化还原酶 | 催化 | 可能将乙酸还原为乙醛进而生成乙醇，导致acsA敲除株乙酸消失 |
| Escherichia coli | 重组蛋白表达 | acsA (CAETHG_1620-1621) | FLAG标记的AcsA蛋白 | 调控 | E. coli中acsA不产生翻译通读，仅产生截短蛋白，说明通读机制菌种特异 |
关键发现
- ['acsA敲除菌株在CO条件下培养48天无生长，野生型第8天OD600达1.98
- 在H₂/CO₂条件下27天无生长，野生型约15天达稳定期OD600 0.17', 'acsA敲除菌株在果糖（10 g/L）上生长OD600比野生型低61%（P<0.0001），且延迟期更长', 'acsA敲除菌株在果糖生长中仅瞬时产生微量乙酸（第2.8天2.6 mM），而野生型产生86.0 mM乙酸', 'acsA敲除菌株的乙醇产量增加113%、2,3-丁二醇增加138%、乳酸增加125%（相对野生型）', 'acsA互补菌株（表达全长acsA）恢复部分表型：OD600从1.77升至3.11（野生型水平的69%），乙酸产量从2.5 mM升至30.78 mM，乙醇从102.74 mM降至65.35 mM，2,3-丁二醇从10.95 mM降至6.66 mM', '混合营养（果糖+CO）条件下，acsA敲除菌株产生2.03 mmol CO，而野生型消耗8.52 mmol CO，表明cooS1和cooS2不能催化CO氧化', 'cooS1敲除菌株在CO上生长延迟期长约2.9天，OD600低42%（P=0.0002），乙酸产量低25%，乙醇产量高64%
- 在H₂/CO₂条件下无延迟期且OD600是野生型的2倍', 'cooS2敲除菌株对CO和H₂/CO₂自养生长影响不显著', 'C. autoethanogenum的acsA基因含内部TGA终止密码子，导致翻译通读产生全长69 kDa蛋白和截短44 kDa蛋白，同时44 kDa为主要产物
- 在E. coli中则无通读产物', '将内部TGA突变为TCA后，C. autoethanogenum中仅检测到69 kDa全长蛋白
- 突变为TAA则完全消除全长蛋白翻译']
研究结论
acsA编码的CODH/ACS复合体是C. autoethanogenum自养生长（CO或H₂/CO₂）所必需的，而cooS1和cooS2是非必需的，且不能补偿acsA的功能。acsA失活导致异养生长受损，并完全消除乙酸生成，将碳流转向乙醇、2,3-丁二醇和乳酸。acsA内部的TGA终止密码子通过低频率翻译通读产生全长蛋白，该机制为C. autoethanogenum特有。cooS1失活可提高H₂/CO₂条件下的生长，可能成为提高气体利用效率的代谢工程策略。