Methylerythritol Phosphate Pathway of Isoprenoid Biosynthesis
- 作者
- Lishan Zhao, Wei-chen Chang, Youli Xiao, Hung-wen Liu, Pinghua Liu
- 单位
- Amyris, Inc.; University of Texas at Austin; Boston University
- 杂志
- Annual Review of Biochemistry（2013）
- DOI
- 10.1146/annurev-biochem-052010-100934
- 所属领域
- 代谢工程/合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
解析甲基赤藓醇磷酸（MEP）途径中酶的催化机制，并探讨基于MVA和MEP途径的微生物合成生物学应用，以解决异戊二烯类化合物生产困难的问题。
研究策略
综述MEP途径各酶（DXS、DXR/IspC、IspD、IspE、IspF、IspG、IspH）的催化机制研究，结合铁硫簇表征、动力学、同位素标记、晶体结构及底物类似物探针等方法；同时回顾了利用MVA和MEP途径在大肠杆菌和酵母中生产青蒿酸和紫杉二烯前体的合成生物学里程碑工作。
核心内容
该综述系统梳理了甲基赤藓醇磷酸（MEP）途径七个酶的催化机制研究进展，重点聚焦铁硫簇酶IspG和IspH的独特反应机理。通过整合动力学分析、同位素标记、晶体结构和底物类似物探针等手段，研究揭示了IspH催化HMBPP还原脱水生成IPP与DMAPP的比例为5:1，而IspG在约450 mV还原电位下活性最高，使用还原甲基紫精可比NADPH-黄素氧还蛋白系统提高活性20倍。底物类似物实验显示IspH对天然底物HMBPP的kcat/Km达30.6 μM⁻¹min⁻¹，而类似物活性显著降低，证实了底物结构的精确识别需求。值得注意的是，IspF在致病菌中表现出显著副反应活性，疟原虫来源IspF催化CDP-MEP生成副产物的速率约为生理反应的10%，提示其可作为抗疟药物靶点。在应用层面，综述回顾了通过工程化大肠杆菌和酵母的MVA/MEP途径成功生产青蒿酸前体和紫杉二烯前体的里程碑工作，表明优化铁硫簇还原系统是提升异戊二烯类化合物微生物合成效率的关键方向，为代谢工程改造提供了理论依据。
创新点
系统总结了IspG和IspH铁硫簇酶奇特催化机制的研究进展，包括IspG的位置同位素交换实验、IspH的底物/产物复合物晶体结构以及有机金属中间体模型的提出；还对比了MVA与MEP途径在不同生物界的分布，并强调了还原系统对铁硫簇酶活性的关键影响。
研究对象（14）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | MEP | dxs | DXS (1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase) | 催化 | TPP依赖的丙酮酸与D-甘油醛-3-磷酸缩合生成DXP |
| Escherichia coli | MEP | dxr/ispC | DXR (DXP reductoisomerase) | 催化 | 催化DXP可逆异构化为MEP，需NADPH和金属离子，遵循retroaldol/aldol机制 |
| Escherichia coli | MEP | ispD | IspD (CDP-ME synthetase) | 催化 | 催化MEP与CTP偶联生成CDP-ME |
| Escherichia coli | MEP | ispE | IspE | 催化 | ATP依赖的C2羟基磷酸化，生成CDP-MEP |
| Escherichia coli | MEP | ispF | IspF | 催化 | 催化CDP-MEP环化生成MEcPP；E. coli和P. falciparum的IspF还可催化副反应 |
| Escherichia coli | MEP | ispG | IspG (GcpE) | 催化 | [4Fe-4S]蛋白，催化MEcPP还原脱水生成HMBPP；活性依赖还原系统 |
| Escherichia coli | MEP | ispH | IspH (LytB) | 催化 | [4Fe-4S]蛋白，催化HMBPP还原脱水生成IPP和DMAPP（比例5:1） |
| Arabidopsis thaliana | MEP | ispG | IspG (GcpE) | 催化 | 植物质体IspG，ferredoxin可作为还原系统 |
| Thermosynechococcus elongatus | MEP | ispG | IspG | 催化 | 蓝藻IspG与铁氧还蛋白相互作用 |
| Methanocaldococcus jannaschii | modified MVA | ipk | Isopentenyl phosphate kinase (IPK) | 催化 | 催化异戊烯基磷酸磷酸化为IPP |
| Saccharomyces cerevisiae | MVA | — | HMG-CoA reductase, farnesyl pyrophosphate synthase, amorphadiene synthase等 | 催化 | 用于青蒿酸前体amorpha-4,11-diene的微生物生产 |
| Escherichia coli | MEP/MVA | — | Taxadiene synthase, P450等 | 催化 | 用于紫杉二烯前体taxadien-5α-ol的生产 |
| — | MEP | fldA | Flavodoxin I | 能量供给 | E. coli中IspG的体内还原系统候选，提供还原力 |
| — | MEP | — | Ferredoxin | 能量供给 | 植物和蓝藻中IspG的电子供体 |
关键发现
- MEP途径是细菌、绿藻和高等植物质体中合成异戊二烯前体IPP和DMAPP的主要途径
- IspH催化HMBPP还原脱水生成IPP和DMAPP，比例为5:1，而IDI介导的平衡比例为1:3
- IspG在最佳还原电位（~450 mV）下活性最高，使用还原甲基紫精比NADPH-黄素氧还蛋白/黄素氧还蛋白还原酶系统活性提高20倍
- IspG在无还原剂时可将环氧化物底物26不可逆转化为MEcPP，kcat约2.9 min-1
- IspF可发生副反应，E. coli和P. falciparum的IspF催化CDP-ME生成环磷酸24的速率约为生理反应的1%，疟原虫IspF催化CDP-MEP生成25的速率约为10%
- DXR催化中[3-2H]-DXP和[4-2H]-DXP的次级动力学同位素效应分别为1.04±0.02和1.11±0.02
- IspH底物类似物41、42、43、44、45的kcat/Km分别为0.27、0.02、0.68、2.52×10^-4和0.21 μM-1 min-1，而天然底物HMBPP的kcat/Km为30.6 μM-1 min-1，kcat为604 min-1，Km为19.7 μM
- 合成生物学方面，通过工程化大肠杆菌和酵母的MVA/MEP途径可高效生产青蒿酸前体amorpha-4,11-diene和紫杉二烯前体taxadien-5α-ol。
研究结论
MEP途径酶尤其是IspG和IspH的催化机制仍存在争议，但铁硫簇在底物活化和还原中具有直接作用；优化还原系统可大幅提高酶活性。基于MVA和MEP途径的微生物发酵已成功实现重要异戊二烯化合物的生产，展示了代谢工程和合成生物学在异戊二烯类药物和燃料生产中的巨大潜力。