Discovery and functional characterization of two diterpene synthases for sclareol biosynthesis in Salvia sclarea (L.) and their relevance for perfume manufacture
- 作者
- Anne Caniard, Philipp Zerbe, Sylvain Legrand, Allison Cohade, Nadine Valot, Jean-Louis Magnard, Jörg Bohlmann, Laurent Legendre
- 单位
- Michael Smith Laboratories, University of British Columbia, 301-2185 East Mall, Vancouver, BC V6T 1Z4, Canada; Université Lille Nord de France, Lille F-59000, France; Université Lille1, Villeneuve d'Ascq F-59655, France; Stress Abiotiques et Différenciation des Végétaux Cultivés (SADV), UMR INRA 1281, Bâtiment SN2, Villeneuve d'Ascq F-59655, France; Université de Lyon, Saint-Etienne F-42023, France; Université de Saint-Etienne, Jean Monnet, Saint-Etienne F-42000, France; Laboratoire BVpam, EA3061, 23 rue du Dr Paul Michelon, Saint-Etienne F-42000, France; Université de Lyon, Lyon F-69622, France; Université Lyon 1, Villeurbanne, France; CNRS, UMR5557, Ecologie Microbienne, Villeurbanne, France
- 杂志
- BMC Plant Biology（2012）
- DOI
- 10.1186/1471-2229-12-119
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
香紫苏醇生物合成途径中关键二萜合酶的鉴定与功能表征，以及其在酵母中异源生产
研究策略
基于454转录组测序数据挖掘候选二萜合酶基因，克隆全长cDNA，进行异源表达、体外酶活分析、系统发育分析、亚细胞定位，并在酵母中构建共表达体系生产香紫苏醇
核心内容
本研究从鼠尾草的454转录组数据中挖掘并克隆了两个参与香紫苏醇生物合成的单功能二萜合酶基因SsLPPS和SsSS。SsLPPS属于class II二萜合酶，分子量约83 kDa，以GGPP为底物主要生成LPP并伴有少量CPP；SsSS属于class I二萜合酶，分子量约61 kDa，可将LPP转化为香紫苏醇，副产物为manool。体外酶活实验和系统发育分析表明，这两个酶可在二萜骨架上直接引入羟基，无需P450氧化酶参与。通过N端信号肽引导，二者定位于质体。在酿酒酵母中构建共表达体系，同时引入ScGGPPS、SsLPPS和SsSS后，在培养基和细胞中均检测到香紫苏醇，且培养基中杂质更少。田间数据显示，鼠尾草每公顷每两年可产10–15 kg花序，香紫苏醇含量为1–2.5%，提取收率最高约35%，纯度可达95%。该工作首次阐明香紫苏醇两步酶催化合成机制，并在酵母中实现异源生产，为建立可持续的规模化香紫苏醇制造平台提供了关键酶学基础和代谢工程策略。
创新点
1. 首次克隆并功能鉴定了香紫苏醇生物合成所需的两个单功能二萜合酶SsLPPS和SsSS；2. 证明这两个酶可直接在二萜骨架上引入羟基，无需P450氧化酶；3. 在酵母中实现了香紫苏醇的异源合成
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae | 香紫苏醇生物合成 | — | — | 区室化 | 作为异源生产宿主，共表达ScGGPPS、SsLPPS和SsSS后成功产生sclareol |
| Escherichia coli | — | — | — | 区室化 | 用于重组蛋白表达和体外酶活分析 |
| Nicotiana benthamiana | — | — | — | 区室化 | 通过瞬时表达GFP融合蛋白验证SsLPPS和SsSS的质体定位 |
| — | 香紫苏醇生物合成途径 | — | — | 催化 | 由GGPP经LPP两步生成sclareol |
| Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae | 香紫苏醇生物合成 | SsLPPS | SsLPPS | 催化 | class II二萜合酶，催化GGPP环化生成LPP，次要产物为CPP，分子量83 kDa，定位于质体 |
| Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae | 香紫苏醇生物合成 | SsSS | SsSS | 催化 | class I二萜合酶，催化LPP转化为sclareol，副产物manool，分子量61 kDa，定位于质体 |
| Escherichia coli | 二萜生物合成（推测） | SsdiTPS3 | SsdiTPS3 | 催化 | 系统发育上属于TPS-e亚家族，但对GGPP、LPP、CPP均无活性，分子量85 kDa |
| Saccharomyces cerevisiae | 萜类前体生物合成 | ScGGPPS | ScGGPPS | 催化 | 酵母自身的GGPP合酶，用于提供GGPP底物 |
关键发现
- 克隆并功能鉴定了两个香紫苏醇生物合成关键酶：SsLPPS（class II二萜合酶，83 kDa）和SsSS（class I二萜合酶，61 kDa）。SsLPPS以GGPP为底物主要生成LPP，并伴有少量CPP
- SsSS将LPP转化为sclareol，副产物为manool。体外联合酶活实验和酵母体内实验均证实二者协同合成sclareol。酵母共表达ScGGPPS、SsLPPS、SsSS后，在培养基和细胞中均检测到sclareol，且培养基中杂质更少。田间生产数据显示，鼠尾草每公顷每两年产10-15 kg花序，香紫苏醇含量1-2.5%，提取收率最高约35%，纯度可达95%。此外，SsLPPS和SsSS的N端信号肽引导其定位于质体。
研究结论
香紫苏醇的生物合成由两个单功能二萜合酶SsLPPS和SsSS分两步催化完成，无需P450氧化酶。在酵母中通过共表达SsLPPS和SsSS成功实现了香紫苏醇的异源合成，为建立规模化、可持续的香紫苏醇生产平台奠定了基础。