Differential transcriptome analysis of glandular and filamentous trichomes in Artemisia annua
- 作者
- Sandra SA Soetaert, Christophe MF Van Neste, Mado L Vandewoestyne, Steven R Head, Alain Goossens, Filip CW Van Nieuwerburgh, Dieter LD Deforce
- 单位
- Laboratory of Pharmaceutical Biotechnology, Faculty of Pharmaceutical Sciences, Ghent University; Department of Plant Systems Biology, VIB and Department of Plant Biotechnology and Bioinformatics, Ghent University; Next Generation Sequencing Core, The Scripps Research Institute
- 杂志
- BMC Plant Biology（2013）
- DOI
- 10.1186/1471-2229-13-220
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
比较青蒿（Artemisia annua）腺毛与丝状毛的转录组，深入了解青蒿素及其他代谢物的生物合成途径，寻找可能参与青蒿素生物合成特别是末端过氧桥形成步骤的候选基因，以降低青蒿素生产成本。
研究策略
利用激光压力弹射分别收集腺毛、丝状毛以及腺毛的顶端细胞和亚顶端细胞，提取RNA进行Illumina RNA-Seq测序；用Trinity从头组装转录组，edgeR进行差异表达分析，MapMan可视化代谢通路；并用qRT-PCR验证关键基因的表达。
核心内容
本研究利用激光压力弹射技术分别收集青蒿腺毛、丝状毛及腺毛的顶端与亚顶端细胞，通过Illumina RNA-Seq测序和Trinity从头组装，系统比较了两类毛状体的转录组差异。共获得150,288个contigs，其中631个在腺毛与丝状毛间显著差异表达，427个在腺毛中高表达。腺毛中MEP途径全部酶基因及MVA途径的AACT、HMGR显著上调，已知青蒿素生物合成基因除RED1外均高表达，同时脂质合成基因占腺毛上调基因的15%，腺毛叶片精油含量（0.24%鲜重）远高于无腺毛叶片（0.06%）。丝状毛中则发现8-epi-cedrol synthase和未表征的oxidosqualene cyclase显著上调，提示其存在独立的萜类代谢。研究还鉴定出多个在腺毛中高表达的氧化酶候选基因，如CYP81B1高表达6 log2倍、CYP76B1高表达32倍。这些候选氧化酶可能参与青蒿素末端过氧桥的形成，为在酵母中异源生产青蒿素提供了潜在靶点，也为解析两类毛状体特化代谢的调控机制奠定了基础。
创新点
首次对青蒿腺毛和丝状毛进行全面的转录组差异分析；发现丝状毛中也存在特定的萜类代谢途径（如8-epi-cedrol synthase和未表征的oxidosqualene cyclase上调）；鉴定出一批在腺毛中高表达的细胞色素、过氧化物酶和双加氧酶作为青蒿素生物合成的候选基因。
研究对象（16）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Artemisia annua glandular trichome | 青蒿素生物合成 | ADS | amorpha-4,11-diene synthase | 催化 | 催化法尼基焦磷酸（FPP）环化生成amorpha-4,11-diene，在腺毛中显著上调 |
| Artemisia annua glandular trichome | 青蒿素生物合成 | CYP71AV1 | amorpha-4,11-diene monooxygenase | 催化 | 细胞色素P450，催化amorpha-4,11-diene氧化生成青蒿醇/青蒿醛/青蒿酸 |
| Artemisia annua glandular trichome | 青蒿素生物合成 | ADH1 | alcohol dehydrogenase 1 | 催化 | 催化青蒿醇氧化为青蒿醛 |
| Artemisia annua glandular trichome | 青蒿素生物合成 | ALDH1 | aldehyde dehydrogenase 1 | 催化 | 催化青蒿醛氧化为青蒿酸，也可作用于二氢青蒿醛生成二氢青蒿酸 |
| Artemisia annua glandular trichome | 青蒿素生物合成 | DBR2 | artemisinic aldehyde Δ11(13) double bond reductase | 催化 | 还原青蒿醛生成二氢青蒿醛 |
| Artemisia annua glandular trichome | 青蒿素生物合成 | RED1 | dihydroartemisinic aldehyde reductase | 催化 | 还原二氢青蒿醛为二氢青蒿醇，在腺毛中未显著上调 |
| Artemisia annua glandular trichome | MEP途径 | DXS/DXR/MCT/CMK/MCS/HDS/HDR | MEP途径各酶 | 催化 | 所有MEP途径酶基因在腺毛中显著上调 |
| Artemisia annua glandular trichome | MVA途径 | AACT, HMGR | acetyl-CoA C-acetyltransferase; 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase | 催化 | MVA途径中仅AACT和HMGR显著上调，HMGR是青蒿素生物合成限速酶 |
| Artemisia annua glandular trichome | 脂质生物合成 | TFAR1 | fatty acyl-CoA reductase 1 | 催化 | 催化脂酰-CoA生成脂肪醇，可能参与蜡质形成，在腺毛中显著上调 |
| Artemisia annua glandular trichome | 萜类代谢（候选基因） | comp69_c0_seq1_1 | CYP81B1 | 催化 | 细胞色素P450，可能催化脂肪酸羟化/环氧化，在腺毛中高表达约6 log2倍 |
| Artemisia annua glandular trichome | 萜类代谢（候选基因） | comp548_c0_seq1_1/seq2_1 | CYP82家族P450 | 催化 | 与CYP82C9v3同源，可能参与高萜类氧化，在腺毛中高表达约5 log2倍 |
| Artemisia annua glandular trichome | 萜类代谢（候选基因） | comp15043_c0_seq2_1 | CYP76B1 | 催化 | 在腺毛中高表达32倍（log2约5），可能参与青蒿素生物合成 |
| Artemisia annua glandular trichome | 萜类代谢（候选基因） | comp252_c0_seq1_1/seq3_1/seq4_1/seq5_1, comp2084, comp6217 | peroxidase 49 precursor; glutathione peroxidase等 | 催化 | 过氧化物酶，可能催化过氧桥形成；comp6217在腺毛中高表达30倍，comp252高表达约6 log2倍 |
| Artemisia annua glandular trichome | 苯丙烷类代谢（候选基因） | comp225_c0_seq1_1, comp453_c0_seq1_1 | flavanone 3-hydroxylase (naringenin 2-oxoglutarate 3-dioxygenase) | 催化 | 双加氧酶，可能在腺毛中参与黄酮类或青蒿素相关氧化反应，高表达约4 log2倍 |
| Artemisia annua filamentous trichome | 倍半萜生物合成 | comp2645 | 8-epi-cedrol synthase | 催化 | 催化FPP生成8-epicedrol、cedrol等，在丝状毛中显著上调 |
| Artemisia annua filamentous trichome | 三萜生物合成 | comp7642_c0_seq2_1 | uncharacterized oxidosqualene cyclase (U_OSC) | 催化 | 与dammarenediol synthase/β-amyrin synthase同源，在丝状毛中显著上调 |
关键发现
- 共组装获得150,288个contigs，平均长度412 bp（最小201 bp，最大7775 bp），84%的contigs在NCBI非冗余蛋白库中有BLAST hit
- 共有631个contigs在腺毛和丝状毛间显著差异表达（adjusted p<0.05），其中427个在腺毛中高表达，204个在丝状毛中高表达
- 腺毛中MEP途径全部酶基因和MVA途径的AACT、HMGR显著上调，已知青蒿素生物合成基因（除RED1外）均显著上调
- 脂质生物合成相关基因占腺毛上调基因的15%，且腺毛叶片精油含量为鲜重的0.24%，无腺毛叶片仅0.06%
- 丝状毛中8-epi-cedrol synthase和未表征的oxidosqualene cyclase显著上调
- 候选基因CYP81B1（comp69）在腺毛中高表达6 log2倍，CYP82（comp548）高表达约5 log2倍，CYP76B1（comp15043）高表达32倍，过氧化物酶comp6217高表达30倍
- 茉莉酸（JA）处理未引起转录组显著变化，顶端与亚顶端细胞间亦无显著差异表达基因。
研究结论
青蒿腺毛具有强大的代谢能力，MEP/MVA、萜类和脂质合成途径显著富集；丝状毛也存在特定的倍半萜和三萜代谢途径。鉴定出的候选氧化酶基因可能参与青蒿素过氧桥的形成，未来可用于在酵母中异源生产青蒿素。