高级醇 · 代谢工程文献库

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Positive genetic interactors of HMG2 identify a new set of genetic perturbations for improving sesquiterpene production in Saccharomyces cerevisiae

作者
Codruta Ignea, Fotini A Trikka, Ioannis Kourtzelis, Anagnostis Argiriou, Angelos K Kanellis, Sotirios C Kampranis, Antonios M Makris
单位
Centre International de Hautes Etudes Agronomiques Mediterranéennes, Mediterranéen Agronomic Institute of Chania; Institute of Applied Biosciences/CERTH; School of Biology, Aristotle University of Thessaloniki; Group of Biotechnology of Pharmaceutical Plants, Lab. of Pharmacognosy, Department of Pharmaceutical Sciences, Aristotle University of Thessaloniki; Department of Medicine, University of Crete
杂志
Microbial Cell Factories（2012）
DOI
10.1186/1475-2859-11-162
所属领域
代谢工程
关键词
CaryophylleneERADHMG2Heterozygous deletionSaccharomyces cerevisiaeSesquiterpene
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解决的核心问题

如何通过基因扰动在不影响细胞生长的情况下提高酿酒酵母的倍半萜（尤其是石竹烯）产量，并识别新的可操作基因靶点。

研究策略

利用HMG2阳性遗传互作基因，通过二倍体杂合缺失（单等位基因缺失）降低基因表达，组合多重缺失以稳定Hmgp并增加FPP前体供应，从而提高倍半萜产量。

研究路线图

研究问题：通过基因扰动提高酵母倍半萜产量且不影响生长
策略：利用HMG2阳性互作基因进行杂合缺失筛选
关键改造：串联杂合缺失UBC7、SSM4/DOA10、PHO86
结果：石竹烯产量125mg/L，比对照提高11-50倍
结论：杂合缺失策略有效提升倍半萜产量且不损伤生长
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核心内容

本研究以酿酒酵母为底盘，利用HMG2正向遗传互作基因筛选策略提升倍半萜（石竹烯）产量。作者鉴定出UBC7、SSM4/DOA10和PHO86三个基因，采用二倍体杂合缺失（单等位基因缺失）方式降低其表达，以避免纯合缺失带来的生长缺陷。通过串联杂合缺失这三个基因，石竹烯产量达到125 mg/L，较未修饰菌株（11.2 mg/L）提高11倍，较野生型提高50倍。机制研究表明，该策略通过稳定Hmg1p和Hmg2p蛋白（Hmg1p稳定性较野生型提高约3倍），增强甲羟戊酸途径通量并增加FPP前体供应；而在过表达HMG2(K6R)背景下，DOA1杂合缺失可使产量进一步提升5倍。此外，多数单基因杂合缺失即可使产量提高2倍以上，且杂合缺失菌株生长正常，而相应纯合缺失则严重受损。该工作首次将HMG2正向遗传互作基因应用于倍半萜生产，证明杂合缺失策略可在不牺牲细胞生长的情况下实现产量协同提升，为酵母细胞工厂的遗传改造提供了新的可行靶点。

创新点

1. 首次将HMG2正向遗传互作基因用于倍半萜产量提升；2. 利用杂合缺失（haploinsufficiency）避免纯合缺失的生长缺陷；3. 鉴定出UBC7、SSM4/DOA10、PHO86三个基因的串联杂合缺失可协同提高产量11倍；4. 证明杂合缺失的效应源于Hmg1p和Hmg2p的稳定化。

研究对象（28）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Saccharomyces cerevisiae 甲羟戊酸（MVA）途径 HMG1 Hmg1p 催化 HMG-CoA还原酶同工酶之一，杂合缺失可提高其蛋白稳定性，增强MVA通量。
Saccharomyces cerevisiae 甲羟戊酸（MVA）途径 HMG2 Hmg2p 催化 HMG-CoA还原酶同工酶之一，是调控的关键靶点；研究中过表达稳定变体HMG2(K6R)以提高前体供应。
Saccharomyces cerevisiae 倍半萜生物合成 Sf126 石竹烯合酶（trans-caryophyllene synthase） 催化 来自Salvia fruticosa的倍半萜合酶，催化FPP生成>90%反式-β-石竹烯。
Saccharomyces cerevisiae 甾醇生物合成（竞争FPP） ERG9 Erg9p（角鲨烯合酶） 催化 催化FPP转化为角鲨烯，单等位基因缺失可减少对FPP的竞争，已在AM94中引入。
Saccharomyces cerevisiae ERAD（内质网相关降解） UBC7 Ubc7p 调控 泛素结合酶E2，参与Hmgp的泛素化降解；其杂合缺失可稳定Hmgp并提高石竹烯产量。
Saccharomyces cerevisiae ERAD SSM4/DOA10 Doa10p 调控 E3泛素连接酶，与Ubc7p协同介导Hmgp降解；杂合缺失与UBC7杂合缺失协同增效。
Saccharomyces cerevisiae ERAD PHO86 Pho86p 调控 ER驻留蛋白，参与分泌途径货物输出，杂合缺失可提高Hmg1p稳定性。
Saccharomyces cerevisiae ERAD HRD1 Hrd1p 调控 E3泛素连接酶，HRD复合物核心组分，直接识别Hmgp并催化泛素化。
Saccharomyces cerevisiae ERAD HRD3 Hrd3p 调控 HRD复合物组分，参与底物识别。
Saccharomyces cerevisiae ERAD UBI4 Ubi4p（泛素） 调控 编码泛素，参与蛋白降解；单等位基因缺失可增加产量。
Saccharomyces cerevisiae ERAD UBX2 Ubx2p 调控 将Cdc48复合物招募至ERAD底物。
Saccharomyces cerevisiae ERAD CUE1 Cue1p 调控 将Ubc7p锚定至ER膜。
Saccharomyces cerevisiae ERAD DER1 Der1p 调控 Derlin蛋白，参与ERAD底物跨膜转运。
Saccharomyces cerevisiae ERAD NPL4 Npl4p 调控 Cdc48-Npl4-Ufd1复合物组分，参与底物提取。
Saccharomyces cerevisiae ERAD DOA1 Doa1p 调控 参与泛素代谢，其杂合缺失在HMG2(K6R)背景下使产量提高5倍。
Saccharomyces cerevisiae NADPH供应/谷氨酸代谢 GDH1 Gdh1p 能量供给 谷氨酸脱氢酶，缺失可增加胞质NADPH，为HMGR提供还原力；此前报道使cubebol产量提高85%。
Saccharomyces cerevisiae ER稳态/钙离子转运 SPF1 Spf1p 转运 ER中的P型ATP酶，维持ER离子稳态和Hmgp诱导的ER重构。
Saccharomyces cerevisiae 脂质代谢/内质网膜重构 CHO2 Cho2p 催化 磷脂酰乙醇胺甲基转移酶，催化脂质合成，影响ER膜重构和Hmgp稳定性。
Saccharomyces cerevisiae 细胞生长调控/应激响应 WHI2 Whi2p 调控 参与营养感知和凋亡调控，杂合缺失与ubc7/UBC7协同使石竹烯产量提高>3.5倍。
Saccharomyces cerevisiae 细胞壁完整性/信号转导 SSD1 Ssd1p 调控 RNA结合蛋白，参与细胞壁完整性调控，杂合缺失可提高产量。
Saccharomyces cerevisiae MAPK信号/内吞 SKM1 Skm1p 调控 PAK家族激酶，参与信号转导，杂合缺失可提高产量。
Saccharomyces cerevisiae 碳代谢/氧化还原 GRE3 Gre3p 催化 醛糖还原酶，可能通过影响NADPH消耗影响Hmgp活性，杂合缺失可提高产量。
Saccharomyces cerevisiae 囊泡运输/高尔基体功能 RIC1 Ric1p 调控 Rab GEF，参与囊泡运输，杂合缺失可提高产量。
Saccharomyces cerevisiae 细胞壁合成 GAS1 Gas1p 催化 β-1,3-葡聚糖转移酶，参与细胞壁合成，杂合缺失可提高产量。
Saccharomyces cerevisiae 染色质重塑 YTA7 Yta7p 调控 含bromodomain的染色质重塑因子，杂合缺失在培养中表现不稳定。
Saccharomyces cerevisiae RNA代谢 BFR1 Bfr1p 调控 RNA结合蛋白，参与mRNA运输，杂合缺失可提高产量。
Saccharomyces cerevisiae 脂质代谢 DCR2 Dcr2p 催化 可能参与脂质代谢，杂合缺失可提高产量（具体机制未明）。
Saccharomyces cerevisiae 乙醇代谢（阴性对照） ADH1 Adh1p 催化 乙醇脱氢酶，作为阴性对照，其缺失不显著影响产量。

关键发现

  1. 在酿酒酵母中，通过串联杂合缺失UBC7、SSM4/DOA10和PHO86，石竹烯产量达到125 mg/L（摇瓶），比未修饰的AM94菌株（11.2 mg/L）提高11倍，比野生型EG60（2.5 mg/L）提高50倍
  2. 在过表达HMG2(K6R)背景下，DOA1杂合缺失使产量比AMH9对照提高5倍，比野生型二倍体提高20倍
  3. 多数单基因杂合缺失可使产量提高2倍以上
  4. gdh1缺失可使cubebol产量提高85%（背景）
  5. AM109菌株的Hmg1p蛋白稳定性比野生型高约3倍
  6. 双纯合缺失菌株生长受损，而杂合缺失菌株生长正常。

研究结论

HMG2正向遗传互作基因的杂合缺失是一种有效的代谢工程策略，可在不牺牲细胞生长的情况下显著提高酿酒酵母的倍半萜产量。通过组合UBC7、SSM4/DOA10、PHO86等基因的杂合缺失，实现了石竹烯产量的11倍提升（125 mg/L），为酵母细胞工厂的遗传改造提供了新思路。

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