Engineering strategy of yeast metabolism for higher alcohol production
- 作者
- Fumio Matsuda, Chikara Furusawa, Takashi Kondo, Jun Ishii, Hiroshi Shimizu, Akihiko Kondo
- 单位
- Organization of Advanced Science and Technology, Kobe University; Department of Bioinformatic Engineering, Graduate School of Information Science and Technology, Osaka University; Department of Chemical Science and Engineering, Graduate School of Engineering, Kobe University
- 杂志
- Microbial Cell Factories（2011）
- DOI
- 10.1186/1475-2859-10-70
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）在高级醇生产方面的能力远低于大肠杆菌（Escherichia coli），其中心代谢网络的结构限制（如区室化、缺乏捷径反应）导致无法有效供应合成高级醇所需的前体和还原力。
研究策略
采用基于通量平衡分析（FBA）的代谢模拟方法，构建大肠杆菌和酿酒酵母的骨干代谢模型，系统模拟所有单、双、三、四基因缺失突变体的产醇性能，并通过比较代谢网络属性（基本模式数、网络密度、特征路径长度）和引入大肠杆菌基因或融合细胞区室等修改来优化酿酒酵母代谢网络。
研究路线图
核心内容
本研究利用通量平衡分析构建大肠杆菌与酿酒酵母的骨干代谢模型，系统模拟全部单、双、三、四基因缺失突变体的高级醇生产性能，并比较代谢网络属性以解析酿酒酵母产能低下的结构原因。结果显示，大肠杆菌中心代谢的基本模式数为34,880，而酿酒酵母仅690，后者灵活性显著不足，主要受区室化和缺乏捷径反应限制。在不引入外源基因的原始模型中，酿酒酵母基于乙酰-CoA合成1-丁醇的proper strain仅1个；而模拟融合线粒体与胞质区室（iBKSce50Δmit）后，proper strains增至49，网络密度由0.092升至0.113，1-丁醇产量可达0.445 Y_Cmol/Cmol glucose；进一步补充pntAB、edd、pfl等7个大肠杆菌反应（iBKSce50+7），proper strains进一步增至192，产量达0.347 Y_Cmol/Cmol glucose。该研究证实，通过引入异源基因补充代谢功能或融合细胞区室，可有效打破酿酒酵母中心代谢网络的结构瓶颈，大幅提升其高级醇生产潜力，为酵母代谢工程的理性设计提供了明确方向。
创新点
1. 利用小型骨干模型实现了对全部单、双、三、四基因缺失突变体的综合模拟分析；2. 揭示了酿酒酵母中心代谢网络灵活性低的结构原因（区室化和缺乏捷径反应）；3. 提出了通过引入大肠杆菌基因（如pntAB、edd、pfl等）或融合线粒体胞质区室来显著提升酿酒酵母高级醇生产潜力的策略。
研究对象（12）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae | 丙酮酸代谢 | PDC | 丙酮酸脱羧酶 | 催化 | 编码丙酮酸脱羧酶，其缺失在iBKSce50Δmit模型中使1-丁醇产量达0.445 Y_Cmol/Cmol glucose |
| Saccharomyces cerevisiae | 糖酵解 | PGI | 葡萄糖-6-磷酸异构酶 | 催化 | 编码葡萄糖-6-磷酸异构酶，其缺失在iBKSce50+7模型中使1-丁醇产量达0.347 Y_Cmol/Cmol glucose |
| Saccharomyces cerevisiae | 细胞区室化 | — | — | 区室化 | 通过融合细胞质和线粒体代谢网络（iBKSce50Δmit）提高代谢灵活性，增加了proper strains数量 |
| Saccharomyces cerevisiae | 辅因子代谢 | pntAB | 吡啶核苷酸转氢酶 | 能量供给 | 引入大肠杆菌转氢酶，改善NADPH供应，增强高级醇合成还原力 |
| Saccharomyces cerevisiae | 糖酵解（Entner-Doudoroff途径） | edd | 6-磷酸葡糖酸脱水酶 | 催化 | 引入大肠杆菌ED途径关键酶，增加代谢网络捷径 |
| Saccharomyces cerevisiae | 丙酮酸代谢 | pfl | 丙酮酸甲酸裂解酶 | 催化 | 引入大肠杆菌丙酮酸甲酸裂解酶，补充乙酰-CoA合成 |
| Saccharomyces cerevisiae | 回补代谢 | pps | 磷酸烯醇丙酮酸合成酶 | 催化 | 引入大肠杆菌Pps，加强丙酮酸向磷酸烯醇丙酮酸的回补 |
| Saccharomyces cerevisiae | 丙酮酸代谢 | maeD | 苹果酸酶 | 催化 | 引入大肠杆菌苹果酸酶，提供NADPH和丙酮酸 |
| Saccharomyces cerevisiae | 回补代谢 | ppc | 磷酸烯醇丙酮酸羧化酶 | 催化 | 引入大肠杆菌Ppc，补充草酰乙酸以支持1-丙醇等合成 |
| Saccharomyces cerevisiae | 苹果酸代谢 | mdh | 苹果酸脱氢酶 | 催化 | 引入大肠杆菌Mdh，促进苹果酸-草酰乙酸转化 |
| Escherichia coli | 发酵代谢 | adhE | 醛-醇脱氢酶 | 催化 | 基因缺失用于提高1-丁醇产量，模拟中1-丁醇产量提高至0.14 Y_Cmol/Cmol glucose |
| Escherichia coli | 发酵代谢 | ldhA | 乳酸脱氢酶 | 催化 | 基因缺失用于提高1-丁醇和异丁醇产量，模拟中异丁醇产量提高至0.19 Y_Cmol/Cmol glucose |
关键发现
- ['模拟结果显示，大肠杆菌中心代谢的基本模式数为34,880，而酿酒酵母仅690，说明其灵活性远低于大肠杆菌。', '通过基因缺失，大肠杆菌的1-丁醇和异丁醇产量分别可达0.14和0.19 Y_Cmol/Cmol glucose。', '酿酒酵母表达梭菌CoA依赖途径实验仅产生约2.5 mg/L的1-丁醇。', '在酿酒酵母原始骨干模型中，乙酰-CoA来源的1-丁醇仅有1个proper strain
- 修改后的模型iBKSce50Δmit Δpdc可获得0.445 Y_Cmol/Cmol glucose的1-丁醇产量，相对生长速率1.0
- iBKSce50+7 Δpgi可获得0.347 Y_Cmol/Cmol glucose，相对生长速率0.88。', '融合线粒体与胞质模型（iBKSce50Δmit）使1-丁醇（AcCoA来源）的proper strains数从1增至49
- 补充7个大肠杆菌反应的模型（iBKSce50+7）则增至192。', '网络属性方面，iBKSce50的网络密度为0.092，特征路径长度2.92
- iBKSce50Δmit改善为0.113和2.664，iBKSce50+7也显著优化。']
研究结论
通过代谢模拟证实，酿酒酵母高级醇产能低下源于中心代谢网络的结构限制。通过引入大肠杆菌基因补充代谢功能或融合细胞区室，可以显著改善其生产潜力，表明基因补充是酿酒酵母代谢工程的有效策略，为后续合成生物工程提供了方向。