Glycosyltransferase efficiently controls phenylpropanoid pathway
- 作者
- Anna Aksamit-Stachurska, Alina Korobczak-Sosna, Anna Kulma, Jan Szopa
- 单位
- Faculty of Biotechnology, Wroclaw University, Przybyszewskiego 63/77, 51-148 Wroclaw, Poland; Faculty of Biological Sciences, Wroclaw University, Przybyszewskiego 63/77, 51-148 Wroclaw, Poland
- 杂志
- BMC Biotechnology（2008）
- DOI
- 10.1186/1472-6750-8-25
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
此前在马铃薯中过表达二氢黄酮醇还原酶(DFR)虽能显著提高花青素含量，但导致淀粉含量和块茎产量大幅下降（淀粉含量最高降低超过90%），需要在不降低产量和品质的前提下提高花青素等类黄酮类抗氧化物的含量。
研究策略
以过表达DFR的转基因马铃薯系(DFR 11)为受体，用来自Solanum soganadinum的糖基转移酶(UGT)cDNA（GenBank AY033489，受块茎特异B33启动子控制）进行二次转化（super-transformation），使花青素等黄酮类物质糖基化，以降低其反应性，从而期望在保持高花青素含量的同时恢复淀粉含量和块茎产量。
核心内容
该研究以过表达二氢黄酮醇还原酶（DFR）导致淀粉含量和块茎产量严重下降的转基因马铃薯系为受体，利用来自Solanum soganadinum的糖基转移酶（UGT）cDNA进行二次转化，使类黄酮物质糖基化以降低其反应性，从而在维持高抗氧化物质含量的同时恢复产量。通过酶学表征，作者重新鉴定了该UGT的底物特异性，证明其为黄酮醇7-O-糖基转移酶，而非此前预测的花青素5-O-糖基转移酶，其对外源底物山柰酚的Km为8.5 μM。共表达UGT后，多个株系的块茎产量恢复到接近对照水平，山柰酚含量达到对照的4倍以上，绿原酸和异绿原酸分别升至对照的2—3倍和最高6倍，总抗氧化能力提高60%—98%。关键发现是UGT共表达将苯丙烷代谢流从花青素分支转向酚酸和原花青素合成，木质素含量未升高。这表明DFR与UGT共过表达策略能在不牺牲产量的前提下富集酚酸类抗氧化物质，为功能性食品改良提供了可行途径。
创新点
首次采用DFR与UGT共过表达策略，在恢复马铃薯块茎产量的同时维持较高水平的类黄酮和酚酸含量；重新鉴定了S. soganadinum UGT的底物特异性，证明其为黄酮醇7-O-糖基转移酶（而非此前预测的花青素5-O-糖基转移酶），兼有花青素3/5-O-糖基转移酶活性；意外发现UGT共表达使苯丙烷代谢流从花青素分支转向酚酸（绿原酸、异绿原酸、芥子酸）和原花青素合成，为植物酚酸合成调控提供了新途径。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 马铃薯 (Solanum tuberosum cv. Desiree) | 苯丙烷代谢途径/类黄酮生物合成 | DFR (dihydroflavonol 4-reductase) | 二氢黄酮醇4-还原酶 | 催化 | 来自矮牵牛(Petunia hybrida)的cDNA，GenBank X15537；由35S启动子驱动；在DFR11株系中过表达，催化二氢黄酮醇还原为无色花青素，显著提高花青素含量但降低淀粉含量与块茎产量 |
| 马铃薯 (Solanum tuberosum cv. Desiree) | 苯丙烷代谢途径/类黄酮糖基化 | UGT (glycosyltransferase) | 糖基转移酶（黄酮醇7-O-糖基转移酶） | 催化 | 来自Solanum soganadinum的cDNA，GenBank AY033489；由块茎特异B33启动子驱动；在DFR11基础上二次转化，兼有花青素3/5-O-糖基转移酶活性，对山柰酚Km为8.5 μM，对芍药素Km为21.4 μM |
| 大肠杆菌 (Escherichia coli DH5α) | 异源表达 | UGT (glycosyltransferase) | 重组糖基转移酶 | 催化 | 使用pQE30载体表达并纯化重组UGT，用于底物特异性筛选和酶动力学参数测定（UDP-葡萄糖为糖基供体） |
关键发现
- 重组UGT对山柰酚的Km为8.5±0.62 μM、Vmax为268.7±36.3 μmol/s·mg，对芍药素(peonidin)的Km为21.4±1.52 μM
- 共转化株系(DFR/UGT 42、45、46、47、48)的UGT活性比对照高20%-50%，DFR活性保持与DFR11一致
- 块茎产量恢复到接近对照水平（48号株系除外），块茎大小与对照相当
- 天竺葵素糖苷在46号株系为对照的2倍以上、42号株系为1.5倍，但低于DFR11（对照的3倍以上）
- 山柰酚含量在42/45/46/47号株系为对照的4倍以上、48号株系近4倍，且比DFR11升高近2倍
- 绿原酸含量为对照的2-3倍，异绿原酸在46号株系高达对照的6倍，咖啡酸为对照的1.3倍
- 45号株系原花青素含量比对照高31%，而DFR11比对照低22%
- 总抗氧化能力(IC50)比对照高60%-98%
- 抑制亚麻油TBARS生成的能力比对照强60%-85%
- 木质素含量未升高
- 除48号株系外芥子酸糖苷含量均高于对照。
研究结论
在马铃薯中同时过表达DFR与UGT可将苯丙烷代谢流从花青素分支导向酚酸类（绿原酸、异绿原酸、芥子酸）和原花青素合成，山柰酚含量约4倍升高主要归因于UGT对山柰酚的底物偏好；共表达在保持高抗氧化物质含量的同时恢复了块茎产量和淀粉含量，为植物酚酸合成调控及功能性食品改良提供了新策略。