Retinoid production using metabolically engineered Escherichia coli with a two-phase culture system
- 作者
- Hui-Jeong Jang, Sang-Hwal Yoon, Hee-Kyung Ryu, Jung-Hun Kim, Chong-Long Wang, Jae-Yean Kim, Deok-Kun Oh, Seon-Won Kim
- 单位
- Division of Applied Life Science (BK21 Program), PMBBRC, Gyeongsang National University, Jinju 660-701, Korea; Korea Research Institute of Bioscience & Biotechnology, 52 Eoeun-dong, Yuseong-gu, Daejeon, Korea; Department of Bioscience and Biotechnology, Konkuk University, Seoul 143-503, Korea
- 杂志
- Microbial Cell Factories（2011）
- DOI
- 10.1186/1475-2859-10-59
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
利用代谢工程大肠杆菌高效生产类视黄醇（retinoids），解决其化学不稳定和细胞内生物降解的问题
研究策略
在产β-胡萝卜素的大肠杆菌中引入外源β-胡萝卜素15,15'-单(双)加氧酶（BCM(D)O）基因，结合外源甲羟戊酸（MVA）途径增强前体IPP/DMAPP供应，并采用十二烷覆盖的双相培养系统进行原位萃取以减少产物降解
核心内容
该研究通过代谢工程改造大肠杆菌，首次实现微生物发酵生产类视黄醇。研究者将来源于海洋未培养细菌66A03的β-胡萝卜素15,15’-单加氧酶基因经密码子优化后导入产β-胡萝卜素的大肠杆菌，并引入外源甲羟戊酸途径增强异戊烯基焦磷酸前体供应，同时采用十二烷覆盖的双相培养系统进行原位萃取，减少产物胞内降解。关键结果显示，初始视网膜产量仅2.2 mg/L；引入外源MVA途径后视网膜提升至8.7 mg/L，较增强内源MEP途径高4倍。在优化条件下（5 mL十二烷覆盖5 mL培养液、2%甘油、29℃培养72小时），总类视黄醇产量达136 mg/L，其中视网膜67 mg/L、视黄醇54 mg/L、醋酸视黄酯15 mg/L，较初始水平提高68倍。研究证明高效裂解酶、外源前体供应与双相萃取的协同组合可使大肠杆菌成为类视黄醇生产的优良细胞工厂，为这类化学不稳定化合物的微生物合成提供了可行方案。
创新点
首次报道利用代谢工程微生物生产类视黄醇；筛选到基于海洋未培养细菌66A03的密码子优化合成基因SR，具有最高的β-胡萝卜素裂解活性；开发十二烷双相培养系统有效防止胞内降解并提高产量
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli DH5α | β-胡萝卜素合成途径 | crtE, crtB, crtI, crtY, ipiHP1 | CrtE, CrtB, CrtI, CrtY, IPI | 催化 | 来源于泛菌和雨生红球藻，用于合成β-胡萝卜素 |
| Escherichia coli DH5α | MEP途径 | dxs | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶 (DXP synthase) | 催化 | 过表达以增强IPP/DMAPP前体供给 |
| Escherichia coli DH5α | MVA途径 | mvaE, mvaS, mvaK1, mvaK2, mvaD, idi | MvaE, MvaS, MvaK1, MvaK2, MvaD, IDI | 催化 | 外源甲羟戊酸途径，来自粪肠球菌和肺炎链球菌，用于高效合成IPP和DMAPP |
| Escherichia coli DH5α | 类视黄醇合成途径 | SR (synthetic retinoid gene, 密码子优化的blh) | SR (synthetic retinoid synthesis protein，基于uncultured marine bacterium 66A03的Blh) | 催化 | β-胡萝卜素15,15'-单(双)加氧酶，裂解β-胡萝卜素生成视网膜 |
| Escherichia coli | 类视黄醇合成途径 | blh, brp (Halobacterium sp. NRC-1), brp2 (Natronomonas pharaonis), Bcmo1 (Mus musculus) | Blh, Brp, Brp2, BCMO1 | 催化 | 其他测试的BCM(D)O，活性低于SR，且较易降解 |
| Escherichia coli DH5α | 类视黄醇降解相关 | ybbO, eutE, puuC (推测) | 预测的视黄醇脱氢酶/视黄醛脱氢酶 | 催化 | 通过BLAST分析推测与视黄醇/视黄酸代谢相关，但未进行基因操作验证 |
关键发现
- 初始视网膜产量为2.2 mg/L
- 引入外源MVA途径后视网膜产量达8.7 mg/L，比增强MEP途径（dxs过表达）高4倍
- 在5 mL十二烷覆盖于5 mL培养液、2%甘油、29℃培养72小时的条件下，总类视黄醇产量达到136 mg/L，其中视网膜67 mg/L、视黄醇54 mg/L、醋酸视黄酯15 mg/L，相比初始水平提高68倍
- 未加十二烷时最高产量为95 mg/L
- 十二烷覆盖培养72小时后产量为136 mg/L，48小时为122 mg/L
- 无十二烷时48小时产量约60 mg/L
研究结论
通过高效BCM(D)O（SR）、外源MVA途径和十二烷双相培养系统的组合，成功在大肠杆菌中实现136 mg/L类视黄醇的生产（视网膜67 mg/L、视黄醇54 mg/L、醋酸视黄酯15 mg/L），较初始水平提高68倍，证明大肠杆菌可作为类视黄醇生产的优良微生物细胞工厂。