Simultaneous cell growth and ethanol production from cellulose by an engineered yeast consortium displaying a functional mini-cellulosome
- 作者
- Garima Goyal, Shen-Long Tsai, Bhawna Madan, Nancy A DaSilva, Wilfred Chen
- 单位
- Department of Chemical Engineering, University of Delaware, Newark, DE 19716, USA; Department of Chemical and Environmental Engineering, University of California, Riverside, CA 92521, USA; Department of Chemical Engineering and Materials Science, University of California, Irvine, CA 92697, USA
- 杂志
- Microbial Cell Factories（2011）
- DOI
- 10.1186/1475-2859-10-89
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
木质纤维素材料难降解、水解所需酶成本高，且缺乏能够直接利用纤维素进行同步生长与乙醇生产的重组微生物。
研究策略
构建由四种酵母种群组成的合成联合体，利用不同cohesin-dockerin对的特异性相互作用，在酵母表面展示包含内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的功能性mini-cellulosome，实现以磷酸膨胀纤维素（PASC）为底物同时进行细胞生长和乙醇发酵；并用qPCR监测各菌群动态。
研究路线图
核心内容
该研究构建了一个由四种酿酒酵母菌株组成的合成联合体，通过cohesin-dockerin特异性相互作用，在细胞表面组装包含内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的功能性mini-cellulosome，直接以磷酸膨胀纤维素为底物实现同步细胞生长与乙醇发酵。采用组成型Agα1锚定系统和CEN/ARS质粒使展示scaffoldin的细胞超过85%，并利用qPCR定量追踪发酵过程中各菌群动态。结果显示，该联合体最终乙醇产量达1.25 g/L，为理论值的87%，是仅分泌三种游离纤维素酶联合体的3倍，乙醇产率为0.43 g/g PASC；展示mini-cellulosome的菌株终细胞密度增加3倍以上，但对照联合体的总细胞密度约为实验组的85%，不足以解释3倍的产量差异，表明mini-cellulosome的协同水解效应是乙醇高产的主要原因。该研究首次证明合成酵母联合体可在纤维素上同步生长并高效产乙醇，为利用合成微生物联合体实现联合生物加工迈出重要一步。
创新点
1. 首次证明合成酵母联合体能在PASC上同时生长并生产乙醇；2. 采用组成型Agα1锚定系统和CEN/ARS质粒提高scaffoldin表面展示效率（超过85%细胞，高于此前的60%）；3. 利用qPCR定量追踪发酵过程中各酵母种群数量动态。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae BY4742 | 纤维素降解/乙醇发酵 | scaf-ctf（合成mini-scaffoldin基因） | Scaf-ctf 三功能mini-scaffoldin | 区室化 | 由C. cellulolyticum、C. thermocellum和R. flavefaciens的3个cohesin及一个CBM组成，通过Agα1锚定组成型展示在酵母表面，用于组装三种纤维素酶。 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4742 | 纤维素降解 | celA（来自Clostridium thermocellum） | CelA 内切葡聚糖酶 | 催化 | 带有天然dockerin，分泌到胞外后与scaffoldin的cohesin结合。 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4742 | 纤维素降解 | cbh2（来自Trichoderma reesei / CBHII） | CBHII 外切葡聚糖酶（纤维二糖水解酶） | 催化 | 与C. cellulolyticum的dockerin融合，分泌后锚定到scaffoldin。 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4742 | 纤维素降解 | bgl1（来自Thermoascus aurantiacus / Bgl1） | Bgl1 β-葡萄糖苷酶 | 催化 | 与R. flavefaciens的dockerin融合，分泌后锚定到scaffoldin。 |
关键发现
- 最终乙醇产量为1.25 g/L，达到理论值的87%，比仅分泌三种纤维素酶的联合体高3倍
- 乙醇产率为0.43 g/g PASC。表面展示Scaf-ctf的细胞超过85%（此前为60%）。C1联合体中展示功能性mini-cellulosome的SC菌株最终细胞密度增加3倍以上，AT/CB/BF三菌株约增加2倍
- C3联合体总终细胞密度约为C1的85%，不能解释3倍乙醇产量差异，说明mini-cellulosome的协同水解效应是乙醇产量大幅提高的主要原因。qPCR法测得生长曲线与直接计数结果90%一致。
研究结论
该研究证明工程酵母联合体展示功能性mini-cellulosome可以直接在纤维素上同步生长并高效产乙醇，为利用合成微生物联合体实现联合生物加工（CBP）迈出了重要一步。未来通过使用更复杂的天然纤维小体结构有望进一步提高乙醇生产效率。