Combined metabolic engineering of precursor and co-factor supply to increase \(\alpha\) -santalene production by Saccharomyces cerevisiae
- 作者
- Gionata Scalcinati, Siavash Partow, Verena Siewers, Michel Schalk, Laurent Daviet, Jens Nielsen
- 单位
- Department of Chemical and Biological Engineering, Chalmers University of Technology; Firmenich SA, Corporate R&D Division
- 杂志
- Microbial Cell Factories（2012）
- DOI
- 10.1186/1475-2859-11-117
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
通过代谢工程改善前体（FPP）和辅因子（NADPH）供给，提高酿酒酵母中高价值倍半萜α-檀香烯的产量，以替代植物提取和化学合成的经济可行生物制造方法。
研究策略
采用多步骤代谢工程策略，包括：(i) 通过替换ERG9启动子（P_HXT1）和敲除LPP1/DPP1优化FPP分支点；(ii) 过表达截短HMG-CoA还原酶（tHMG1）和FPP合酶（ERG20）增强甲羟戊酸途径通量；(iii) 敲除GDH1并过表达GDH2改造铵同化途径以增加NADPH供给；(iv) 过表达突变的转录因子Upc2-1（upc2-1）增强MVA途径基因表达。所有基因组整合，并利用双相（水/有机溶剂）连续发酵系统进行产物原位回收和评价。
研究路线图
核心内容
该研究通过组合代谢工程策略，在酿酒酵母中系统优化前体法尼基焦磷酸（FPP）与辅因子NADPH的供给，以提升高价值倍半萜α-檀香烯的产量。具体操作包括：以弱启动子P_HXT1替换ERG9启动子并敲除LPP1/DPP1以削减FPP竞争分流，过表达截短HMG-CoA还原酶（tHMG1）和FPP合酶（ERG20）增强甲羟戊酸途径通量，敲除GDH1并过表达GDH2改造铵同化途径以增加NADPH供应，同时整合组成激活的转录因子突变体Upc2-1强化途径基因表达。所有改造均通过基因组整合实现，并采用水/有机溶剂双相连续发酵系统进行产物原位回收。最优菌株SCIGS24在稀释率0.05 h⁻¹下α-檀香烯产量达0.0052 Cmmol/Cmmol葡萄糖，较对照菌株提高4倍，生产力提高6倍；整合upc2-1和tHMG1的菌株SCIGS25总倍半萜产量达0.0069 Cmmol/Cmmol葡萄糖。该研究首次将FPP分支调控、途径扩增、辅因子工程和转录因子工程四种策略整合于同一菌株，结合原位产物去除的恒化培养工艺，显著提升了α-檀香烯的产量与生产力，为建立经济可行的酵母倍半萜生物制造平台奠定了基础。
创新点
首次将FPP分支点调控、MVA途径扩增、铵同化途径辅因子改造和转录因子工程这四种策略组合于同一酵母菌株中；开发了结合原位产物去除（ISPR）的恒化培养工艺，实现连续生产与产物回收一体化。
研究对象（9）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK系列 | 甲羟戊酸途径 | tHMG1 | 截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶 | 催化 | 过表达，编码催化结构域，解除反馈调节，增强甲羟戊酸途径通量 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK系列 | 倍半萜合成途径 | SanSynopt | α-檀香烯合酶（密码子优化） | 催化 | 来源于Clausena lansium，催化FPP转化为α-檀香烯，由质粒pISP15表达 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK系列 | 甲羟戊酸途径（异戊二烯焦磷酸合成） | ERG20 | 法尼基二磷酸合酶（FPPS） | 催化 | 过表达，催化IPP与DMAPP缩合生成GPP和FPP，增强FPP供给 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK系列 | 铵同化途径 | GDH2 | NAD依赖性谷氨酸脱氢酶 | 催化 | 过表达，与GDH1缺失组合，改变NADH/NADPH平衡，增加NADPH可利用性 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK系列 | 铵同化途径 | GDH1 | NADP依赖性谷氨酸脱氢酶 | 催化 | 敲除，减少NADPH消耗，提高NADPH供给 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK系列 | FPP去磷酸化途径 | LPP1 | 脂质磷酸磷酸酶Lpp1 | 催化 | 敲除，减少FPP向法尼醇（FOH）的去磷酸化损耗 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK系列 | FPP去磷酸化途径 | DPP1 | 脂质磷酸磷酸酶Dpp1 | 催化 | 敲除，与LPP1缺失叠加，进一步降低FPP磷酸酶活性，减少法尼醇生成 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK系列 | 甾醇合成途径 | ERG9 | 鲨烯合酶（SQS） | 催化 | 启动子替换为P_HXT1，下调表达，减少FPP向甾醇分支的消耗，提高FPP可用性 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK系列 | 甲羟戊酸途径（转录调控） | upc2-1 | 转录因子Upc2（组成激活突变体） | 调控 | 过表达，携带G888D突变，增强包括ERG13、ERG12、ERG8等MVA基因的转录 |
关键发现
- 最优菌株SCIGS24在稀释率0.05 h^-1下达到α-檀香烯产量0.0052 Cmmol (Cmmol葡萄糖)^-1，相比对照菌株SCIGS28（0.0013 Cmmol/Cmmol）提高4倍
- 生产力为0.036 Cmmol (g biomass)^-1 h^-1，提高6倍。菌株SCIGS25（额外整合upc2-1和tHMG1）总倍半萜（α-檀香烯+法尼醇）产量达0.0069 Cmmol (Cmmol葡萄糖)^-1，生产力达0.052 Cmmol (g biomass)^-1 h^-1。在稀释率0.1 h^-1下，SCIGS29和SCIGS30的α-檀香烯生产力分别达0.041和0.043 Cmmol (g biomass)^-1 h^-1，较对照提高6倍。对照菌株产量为0.0013 Cmmol/Cmmol，生产力0.006 Cmmol (g biomass)^-1 h^-1（约0.086 mg (g biomass)^-1 h^-1）。
研究结论
组合代谢工程策略与优化的双相连续发酵工艺显著提高了酿酒酵母的α-檀香烯产量和生产力，为建立高效的酵母倍半萜生产平台及经济可行的生物基替代工艺奠定了基础。