Effective enhancement of Pseudomonas stutzeri D-phenylglycine aminotransferase functional expression in Pichia pastoris by co-expressing Escherichia coli GroEL-GroES
- 作者
- Kanidtha Jariyachawalid, Poramaet Laowanapiban, Vithaya Meevootisom, Suthep Wiyakrutta
- 单位
- Department of Biotechnology, Faculty of Science, Mahidol University, Rama 6 Road, Bangkok 10400, Thailand; Department of Microbiology, Faculty of Science, Mahidol University, Rama 6 Road, Bangkok 10400, Thailand; Center of Excellent for Agricultural Biotechnology (AG-BIO/PERDO-CHE), Bangkok, Thailand
- 杂志
- Microbial Cell Factories（2012）
- DOI
- 10.1186/1475-2859-11-47
- 所属领域
- 代谢工程
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解决的核心问题
D-苯甘氨酸转氨酶(D-PhgAT)在毕赤酵母中表达时形成不溶性包涵体，可溶性活性酶产量极低，需要提高其功能性表达水平。
研究策略
采用毕赤酵母表达系统，通过共表达大肠杆菌伴侣蛋白GroEL-GroES、增加dpgA与伴侣蛋白基因拷贝数、优化培养条件（温度、添加剂）来促进D-PhgAT正确折叠，提高可溶性活性酶产量。
研究路线图
核心内容
该研究针对D-苯甘氨酸转氨酶在毕赤酵母中表达时形成不溶性包涵体、可溶性活性酶产量极低的问题，采用共表达大肠杆菌伴侣蛋白GroEL-GroES的策略促进目标酶正确折叠。作者在毕赤酵母KM71中单独表达密码子优化的dpgA基因时，目标蛋白虽占细胞总蛋白的30%，但大部分为包涵体，可溶性比活性仅0.0054 U/mg，体积活性仅2.9 U/L；共表达单拷贝GroEL-GroES后体积活性提升至7531 U/L，提高了约2600倍。进一步将dpgA增至3拷贝、groEL-groES增至10拷贝后，体积活性达到41730 U/L，较单独表达提高14400倍。优化培养条件（25°C）后，比活性和体积活性分别达72.7 U/mg和50512 U/L，纯化后比活性达888.6 U/mg。该研究首次证实细菌伴侣蛋白可在毕赤酵母中大幅增强细菌酶的功能性胞内表达，表明通过伴侣共表达与拷贝数、培养条件协同优化，可使毕赤酵母成为高产细菌蛋白的实用宿主。
创新点
首次将细菌伴侣蛋白GroEL-GroES共表达用于增强细菌酶在毕赤酵母中的功能性胞内表达；仅两个细菌伴侣基因即可大幅提高目标酶活性；通过调整基因拷贝数实现高达14400倍的产量提升。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Pichia pastoris KM71 | D-苯甘氨酸合成 | dpgA | D-PhgAT | 催化 | 来自Pseudomonas stutzeri的D-苯甘氨酸转氨酶，催化L-谷氨酸与D-苯甘氨酸间的立体反转转氨基反应 |
| Pichia pastoris KM71 | 蛋白质折叠 | groEL | GroEL | 调控 | 大肠杆菌伴侣蛋白GroEL，与GroES协同促进蛋白质正确折叠 |
| Pichia pastoris KM71 | 蛋白质折叠 | groES | GroES | 调控 | 大肠杆菌伴侣蛋白GroES，辅助GroEL功能 |
关键发现
- 单独表达密码子优化的dpgA时，D-PhgAT蛋白占细胞总蛋白的30%，但大部分为不溶性包涵体，可溶性比活性仅0.0054 U/mg，体积活性2.9 U/L
- 共表达单拷贝GroEL-GroES后，体积活性达7531 U/L（提高约2600倍）
- 将dpgA增至3拷贝、groEL-groES增至10拷贝后，体积活性达41730 U/L，比单独表达高14400倍
- 优化培养条件（25°C、无添加剂）后，比活性和体积活性分别达72.7 U/mg和50512 U/L（较30°C最佳提高1.2倍）
- 纯化后比活性为888.6 U/mg，纯化5.2倍，回收率76.6%。
研究结论
共表达细菌伴侣蛋白GroEL-GroES能显著增强D-PhgAT在毕赤酵母中的功能性表达，优化基因拷贝数和培养条件后产量大幅提升。毕赤酵母具有高密度培养和稳定表达的优势，适合作为细菌蛋白的胞内表达宿主。