Biocatalytic synthesis of flavones and hydroxyl-small molecules by recombinant Escherichia coli cells expressing the cyanobacterial CYP110E1 gene
- 作者
- Takuya Makino, Toshihiko Otomatsu, Kazutoshi Shindo, Emi Kitamura, Gerhard Sandmann, Hisashi Harada, Norihiko Misawa
- 单位
- Research Institute for Bioresources and Biotechnology, Ishikawa Prefectural University; KNC Bio Research Center, KNC Laboratories Co., Ltd; Department of Food and Nutrition, Japan Women's University; Molecular Biosciences 213, J.W. Goethe University; Department of Biotechnology, Graduate School of Agricultural and Life Sciences, The University of Tokyo
- 杂志
- Microbial Cell Factories（2012）
- DOI
- 10.1186/1475-2859-11-95
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
蓝藻P450（尤其是CYP110家族）的催化功能大多未知，缺乏可溶性表达系统和底物谱广的P450工具酶，难以用于合成黄酮类及羟基化小分子化合物。
研究策略
将蓝藻P450基因克隆至pRED载体，与P450RhF（CYP116B2）的RhFRed还原酶域C端融合，在大肠杆菌BL21(DE3)中构建自给自足型P450单加氧酶；通过共培养底物进行底物筛选，并结合HPLC和波谱学鉴定产物结构。
研究路线图
核心内容
该研究将蓝藻来源的CYP110E1基因克隆至pRED载体，与来自P450RhF的RhFRed还原酶域融合，在大肠杆菌BL21(DE3)中构建了自给自足型P450单加氧酶系统。通过共培养底物进行筛选，结合HPLC和波谱学鉴定产物结构，系统考察了该酶的底物谱与催化功能。结果显示，融合蛋白在大肠杆菌中可溶性功能表达，CO差光谱证实其活性。该酶能将柚皮素转化为芹菜素，转化率31.5%；可将黄烷酮转化为3-羟基黄烷酮（5.7%）和黄酮（2.1%），首次发现原核P450具备黄酮合酶活性。此外，CYP110E1展现出广泛的底物混杂性，能转化芝麻酮、多种萘衍生物、非甾体抗炎药甲酯等小分子，生成若干化学法难以获得的羟基化产物，其中部分为新化合物，如zerumbone羟基化产物S-2和S-3。这些结果表明CYP110E1可作为合成黄酮类化合物和多种羟基化小分子的有用工具酶，在医药与营养品领域具有应用潜力。
创新点
['首次发现原核P450具有黄酮合酶活性，可直接将黄烷酮转化为黄酮。', 'CYP110E1表现出广泛的底物混杂性，能转化黄烷酮、芝麻酮、芳香化合物、非甾体抗炎药甲酯等多种小分子，生成多种化学法难以合成的羟基化产物（包括新化合物）。']
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | 黄酮生物合成（黄烷酮→黄酮） | CYP110E1 (alr4833) | CYP110E1 | 催化 | 来自Nostoc sp. PCC 7120，与RhFRed还原酶域融合，具有黄酮合酶活性，将Naringenin转化为Apigenin。 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 萜类化合物羟基化（Zerumbone生物转化） | CYP110E1 (alr4833) | CYP110E1 | 催化 | 羟基化Zerumbone生成新化合物S-2和S-3。 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 芳香化合物羟基化（萘衍生物、药物等） | CYP110E1 (alr4833) | CYP110E1 | 催化 | 转化1-甲氧基萘、1-乙氧基萘、2-甲基萘、1,6-二甲基萘、布洛芬甲酯、氟比洛芬甲酯等多种底物。 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | P450电子传递 | RhFRed（来自Rhodococcus sp. NCIMB 9784 P450RhF） | RhFRed还原酶域 | 能量供给 | 作为CYP110E1的还原伴侣，利用NADPH提供电子，构建自给自足型P450。 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 芳香化合物羟基化（对照） | CYP102A1 (P450BM3) F87V | P450BM3 F87V突变体 | 催化 | 作为对照转化多项底物，与CYP110E1产物互补。 |
关键发现
- CYP110E1与RhFRed融合后在大肠杆菌中功能表达，CO差光谱证实活性。Naringenin转化为apigenin，转化率31.5%
- Flavanone转化为3-hydroxyflavanone（5.7%）和flavone（2.1%）
- 6-hydroxyflavanone转化为6-hydroxyflavone（12.1%）
- 7-hydroxyflavanone转化为7-hydroxyflavone（1.4%）。Zerumbone被羟基化生成新化合物S-2和S-3
- 1-methoxynaphthalene生成A-1（7.5%）、A-2（1.1%）、A-3（2.0%）
- 1-ethoxynaphthalene生成A-4（4.8%）、A-5（4.0%）
- 2-methylnaphthalene生成A-6（3.8%）、A-7（4.7%）
- 1,6-dimethylnaphthalene生成A-8（5.5%）、A-9（2.9%）
- 2-(p-tolyl)pyridine生成A-13（8.4%）
- ibuprofen methylester生成A-14（2.3%）
- flurbiprofen methylester生成A-15（2.7%）和A-16（3.3%）。此外还转化2-bromophenol、4-methylbiphenyl、7-ethoxycoumarine等底物。
研究结论
CYP110E1是一种底物混杂的P450单加氧酶，可用于生物合成黄酮类化合物以及多种化学合成困难的羟基化小分子，在医药和营养品行业具有应用潜力。