In silico profiling of Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae as terpenoid factories
- 作者
- Evamaria Gruchatka, Oliver Hädicke, Steffen Klamt, Verena Schütz, Oliver Kayser
- 单位
- Technical Biochemistry, Department of Biochemical and Chemical Engineering, TU Dortmund University; Analysis and Redesign of Biological Networks, Max Planck Institute for Dynamics of Complex Technical Systems; Biomax Informatics AG
- 杂志
- Microbial Cell Factories（2013）
- DOI
- 10.1186/1475-2859-12-84
- 所属领域
- 代谢工程 / 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
比较大肠杆菌和酿酒酵母作为萜类化合物生产宿主的理论潜力，确定提高异戊烯基二磷酸（IPP）产量的代谢工程策略。
研究策略
基于元素模式分析（EMA）对两种宿主的中央碳代谢网络、DXP/MVA途径及不同碳源进行化学计量分析，计算理论最大IPP产量，并利用约束最小割集（cMCSs）设计敲除策略。
研究路线图
核心内容
本研究基于元素模式分析（EMA）对大肠杆菌和酿酒酵母作为萜类化合物生产宿主的理论潜力进行了系统比较。通过化学计量模型解析两种宿主的中央碳代谢、DXP/MEP与MVA途径及不同碳源条件下的最大异戊烯基二磷酸（IPP）产量，并运用约束最小割集（cMCSs）设计基因敲除策略。结果显示，单独比较途径时，DXP与MVA途径的最大IPP碳产率均为0.83 C-mol/C-mol，但考虑宿主代谢背景后，野生型大肠杆菌最大IPP产量（0.67 C-mol/C-mol，零生长）显著高于酿酒酵母（0.53），有生长条件下分别为0.57和0.39。碳源优化可进一步提升产量，大肠杆菌在甘油上达0.78，酵母在乙醇上为0.68。引入异源途径同样有效，MVA途径导入大肠杆菌后产量为0.56，DXP途径导入酵母后达0.64。cMCSs计算得到的敲除策略能将生长与高于文献报道的IPP产量强制耦合，例如酵母在乙醇上的理论产量0.68远高于文献实验值0.19。研究揭示大肠杆菌DXP途径的理论潜力比酵母MVA途径高出近50%，为选择生产宿主和设计代谢改造策略提供了定量依据。
创新点
首次在计算机上全面定量比较E. coli和S. cerevisiae作为萜类生产菌株的理论产量；识别出新的过表达和敲除靶点；应用cMCSs将生长与高于文献报道的IPP产量强制耦合。
研究对象（18）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | DXP（MEP）途径 | dxs | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶 | 催化 | 限速酶，过表达靶点 |
| Escherichia coli | DXP（MEP）途径 | dxr | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶 | 催化 | 限速酶，过表达靶点 |
| Escherichia coli | DXP（MEP）途径 | ispD | 2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸胞苷酰转移酶 | 催化 | 限速酶，过表达靶点 |
| Escherichia coli | DXP（MEP）途径 | ispF | 2-C-甲基-D-赤藓醇-2,4-环二磷酸合酶 | 催化 | 限速酶，过表达靶点 |
| Escherichia coli | DXP（MEP）途径 | idi | 异戊烯基二磷酸异构酶 | 催化 | 限速酶，过表达靶点 |
| Escherichia coli | 中心碳代谢 | pgi | 葡萄糖-6-磷酸异构酶 | 催化 | cMCSs提示的敲除靶点，可促进萜类生产 |
| Escherichia coli | 能量代谢 | — | 可溶性转氢酶（transhydrogenase） | 能量供给 | 平衡NADH/NADPH，提高IPP产量 |
| Saccharomyces cerevisiae | MVA途径 | HMG1 | 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶 | 催化 | 限速酶，截短过表达可消除反馈抑制 |
| Saccharomyces cerevisiae | MVA途径 | ERG9 | 鲨烯合酶 | 催化 | 下调以减少FPP流向固醇合成 |
| Saccharomyces cerevisiae | MVA途径 | upc2-1 | 转录因子Upc2 | 调控 | 突变体转录上调MVA途径基因 |
| Saccharomyces cerevisiae | 乙酰-CoA合成 | ALD6 | NADP+依赖性乙醛脱氢酶 | 催化 | 组成型表达，提供乙酰-CoA |
| Saccharomyces cerevisiae | 异源DXP途径 | — | — | 催化 | 理论引入，尚未功能性表达 |
| Escherichia coli | 异源MVA途径 | — | — | 催化 | 理论引入，与天然DXP途径共存 |
| Saccharomyces cerevisiae | 木糖代谢 | xylA（XI） | 木糖异构酶 | 催化 | 用于木糖利用的异源途径 |
| Saccharomyces cerevisiae | 木糖代谢 | XR/XDH | 木糖还原酶/木糖醇脱氢酶 | 催化 | 木糖利用替代途径 |
| Escherichia coli | 中心碳代谢 | — | NADP+依赖的甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAP-DH） | 催化 | 过表达候选，提供NADPH |
| Saccharomyces cerevisiae | 中心碳代谢 | — | 胞质丙酮酸脱氢酶复合物（PDH） | 催化 | 过表达候选，调节乙酰-CoA供应 |
| Saccharomyces cerevisiae | 中心碳代谢 | — | ATP-柠檬酸裂解酶（ACL） | 催化 | 过表达候选，生成乙酰-CoA |
关键发现
- DXP与MVA途径单独考虑时碳化学计量相同（最大IPP碳产率0.83 C-mol/C-mol），但纳入宿主代谢后，E. coli野生型最大IPP产量为0.67 C-mol/C-mol（零生长）和0.57（有生长），S. cerevisiae为0.53和0.39
- E. coli在甘油上最大IPP产量为0.78 C-mol/C-mol，S. cerevisiae在乙醇上为0.68
- 引入异源途径或改变碳源可提高产量，例如MVA途径引入E. coli后最大产量为0.56，DXP途径引入S. cerevisiae后为0.64
- cMCSs计算得到的敲除策略可实现高于文献报道的产量（如酵母乙醇实验产量0.19 vs 理论0.68）。
研究结论
E. coli的DXP途径在碳化学计量上比酵母MVA途径的理论潜力高近50%，野生型E. coli的理论IPP产量潜力高于S. cerevisiae；通过异源途径引入、碳源优化和cMCSs敲除策略可显著提升两种宿主的萜类生产潜力。