Efficient one-step production of (S)-1-phenyl-1, 2-ethanediol from (R)-enantiomer plus NAD+-NADPH in-situ regeneration using engineered Escherichia coli
- 作者
- Rongzhen Zhang, Yan Xu, Rong Xiao, Botao Zhang, Lei Wang
- 单位
- Key Laboratory of Industrial Biotechnology of Ministry of Education & School of Biotechnology, Jiangnan University; National Key Laboratory for Food Science, Jiangnan University; Center for Advanced Biotechnology and Medicine, Rutgers University
- 杂志
- Microbial Cell Factories（2012）
- DOI
- 10.1186/1475-2859-11-167
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
在工程化大肠杆菌中，由(R)-1-苯基-1,2-乙二醇(PED)一锅法高效生产(S)-PED时，NAD+和NADPH辅因子不足或比例失衡导致转化效率低、产率低。
研究策略
将大肠杆菌自身的吡啶核苷酸转氢酶(PNTs，即PntA和PntB)引入RCR和SCR共表达体系，通过膜结合转氢酶催化NADH与NADP+互变，重新平衡细胞内NAD(H)和NADP(H)库，实现NAD+与NADPH的原位再生。
研究路线图
核心内容
本研究针对工程化大肠杆菌中由(R)-1-苯基-1,2-乙二醇(PED)一锅法生产(S)-PED时NAD+与NADPH辅因子比例失衡导致的转化效率低的问题，提出将大肠杆菌内源吡啶核苷酸转氢酶(PntA/PntB)引入(R)-羰基还原酶(RCR)与(S)-羰基还原酶(SCR)共表达体系，通过膜结合转氢酶催化NADH与NADP+互变，实现辅因子库的再平衡和NAD+与NADPH的原位再生。实验结果显示，引入PNTs后，当NAD+/NADPH比例为3.0或更高时，RSAB菌株在6小时内实现(S)-PED光学纯度97.4%、产率95.2%，相比未引入PNTs的RS菌株，光学纯度和产率分别提高51.5%和80.6%，反应时间缩短7倍。同时，细胞内NADPH/NADP+与NADH/NAD+的比值从36降至17，NAD+浓度增至2.19 μmol/g dry wt，NADPH降至0.42 μmol/g dry wt。该工作证明辅因子再平衡工程可有效解决手性醇合成中的辅因子瓶颈，为高效一锅法生产手性醇提供了可行策略。
创新点
首次将PNTs引入(S)-PED合成通路，通过辅因子再平衡而非额外添加酶系实现一锅法立体转化；利用膜结合PNTs在细胞内定位，不影响细胞生长；通过优化NAD+/NADPH比例大幅提高光学纯度和产率。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | (S)-1-苯基-1,2-乙二醇合成通路 | rcr | RCR (NAD+-linked (R)-carbonyl reductase) | 催化 | 来自Candida parapsilosis CCTCC M203011，催化(R)-PED氧化为2-羟基苯乙酮(HAP) |
| Escherichia coli BL21(DE3) | (S)-1-苯基-1,2-乙二醇合成通路 | scr | SCR (NADPH-dependent (S)-carbonyl reductase) | 催化 | 来自Candida parapsilosis CCTCC M203011，催化HAP还原为(S)-PED |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 辅因子再生通路 | PntA | PntA (pyridine nucleotide transhydrogenase subunit α) | 调控 | 来自E. coli K12，膜结合转氢酶α亚基，与PntB共同催化NADH+NADP+ ⇌ NAD+ + NADPH，重新平衡辅因子 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 辅因子再生通路 | PntB | PntB (pyridine nucleotide transhydrogenase subunit β) | 调控 | 来自E. coli K12，膜结合转氢酶β亚基，与PntA共同催化NADH+NADP+ ⇌ NAD+ + NADPH，重新平衡辅因子 |
关键发现
- 引入PNTs后，RSAB菌株在NAD+/NADPH比例为3.0或更高时，6小时内(S)-PED的光学纯度达97.4%，产率达95.2%
- 相比RS菌株，光学纯度和产率分别提高51.5%和80.6%，反应时间缩短7倍。PNTs使NADPH/NADP+与NADH/NAD+的比值从36降至17
- 细胞内NAD+和NADH浓度分别增至2.19和0.37 μmol/g dry wt，NADPH降至0.42 μmol/g dry wt。RCR和SCR比活力在RSAB中分别为0.349 U/mg和1.758 U/mg，PNT膜结合比活力约0.10 U/mg。
研究结论
通过在大肠杆菌中引入PNTs，成功重新平衡了辅因子库，实现了(S)-PED从(R)-对映体的一步高效生产，同时进行了NAD+和NADPH的原位再生。该策略为利用辅因子再平衡工程高效生产手性醇提供了新思路。