2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl as a screening tool for recombinant monoterpene biosynthesis
- 作者
- James BYH Behrendorff, Claudia E Vickers, Panagiotis Chrysanthopoulos, Lars K Nielsen
- 单位
- Australian Institute for Bioengineering and Nanotechnology, The University of Queensland, St Lucia QLD 4072, Australia; Metabolomics Australia (Queensland Node), The University of Queensland, St Lucia QLD 4072, Australia
- 杂志
- Microbial Cell Factories（2013）
- DOI
- 10.1186/1475-2859-12-76
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
单萜生物合成检测通常依赖气相色谱-质谱联用（GC-MS），分析通量低，成为菌株和发酵条件组合筛选的严重瓶颈，缺乏简单快速的高通量预筛选方法。
研究策略
开发并优化以十二烷为溶剂的DPPH自由基清除检测法，用于两相微生物培养体系中单萜的定性检测；利用该方法筛选柠檬烯合酶（CLLS与MSLS）及不同培养基成分，并通过GC-MS验证筛选结果，进而改进确定培养基。
研究路线图
核心内容
针对单萜生物合成检测依赖气相色谱-质谱联用（GC-MS）导致通量低、难以大规模筛选菌株和发酵条件的瓶颈，本研究开发并优化了一种以十二烷为溶剂的DPPH自由基清除比色法，用作两相微生物培养体系中单萜的定性预筛选工具。该方法在510 nm波长、100 μM DPPH和聚丙烯板条件下检测，确定了月桂烯、γ-萜品烯和柠檬烯的检测极限分别为10 μM、15 μM和200 μM，而β-蒎烯在2.5 mM以下无法检出。利用该法比较了来自柠檬和留兰香的两种柠檬烯合酶（CLLS与MSLS）及多种培养基成分，筛选出更优的CLLS和YP+培养基，并经GC-MS验证。在50 mL发酵中，CLLS在YP+中柠檬烯产量达1.48±0.22 mg/L（十二烷相浓度542±81 μM），显著高于MSLS的0.26±0.02 mg/L；进一步开发的定义培养基SD(pH)+M产量为0.9±0.15 mg/L，且添加氮源未提升产量。结果表明DPPH法能正确区分不同合酶和培养基的产萜能力，可作为GC-MS前的第一级高通量筛选工具，适用于大规模菌株和发酵条件优化。
创新点
1. 首次系统优化了以十二烷为溶剂的DPPH检测条件（510 nm、100 μM DPPH、聚丙烯板等），并考察了背景反应的影响因素；2. 确定了月桂烯、γ-萜品烯、柠檬烯和β-蒎烯的检测灵敏度；3. 应用该法成功识别出更优的柠檬烯合酶（CLLS）和培养基（YP+），并据此开发了改进的定义培养基。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae EPY210C | 甲羟戊酸途径 | tHMG1 | 截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶 | 催化 | 过表达可溶性tHMG1以增强类异戊二烯前体供应 |
| Saccharomyces cerevisiae EPY210C | 甾醇生物合成调控 | upc2-1 | UPC2转录因子突变体 | 调控 | 全局转录因子，上调甾醇生物合成基因，增加前体供给 |
| Saccharomyces cerevisiae EPY210C | 单萜生物合成 | CLLS | 柠檬烯合酶（Citrus limon） | 催化 | 催化GPP生成柠檬烯；去除质体靶向序列并密码子优化 |
| Saccharomyces cerevisiae EPY210C | 单萜生物合成 | MSLS | 柠檬烯合酶（Mentha spicata） | 催化 | 来自薄荷，催化GPP生成柠檬烯；去除质体靶向序列并密码子优化 |
关键发现
- DPPH在十二烷中最大吸收波长为510 nm，线性范围至1 mM（R²=0.999）
- 检测极限：月桂烯10 μM、γ-萜品烯15 μM、柠檬烯200 μM，β-蒎烯在2.5 mM以下无法检出
- 在50 mL发酵中，CLLS和MSLS在YP+培养基中的柠檬烯产量分别为1.48±0.22 mg/L和0.26±0.02 mg/L（dodecane相浓度分别为542±81 μM和94±7 μM）
- 改进的SD(pH)+M培养基产量为0.9±0.15 mg/L，SD(pH)为0.81±0.11 mg/L，SD+M为0.49±0.02 mg/L，SD(pH)+N为0.45±0.03 mg/L，SD(pH)+MN为0.43±0.05 mg/L
- 添加氮源并未提高产量。
研究结论
DPPH实验作为单萜生物合成的第一级定性筛选工具是可行的，能正确区分不同合酶和培养基的产柠檬烯能力；该方法可推广用于其他单萜的检测，适合大规模菌株和发酵条件的预筛选。